国家自然科学基金(30900896)
- 作品数：13 被引量：33H指数：3
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- 黑麦籽粒Waxy蛋白亚基的高效分离与鉴定技术体系的构建被引量：1
- 2013年
- 【目的】构建用于制备级分离及高效鉴定黑麦籽粒Waxy蛋白亚基的技术体系,为该亚基理化特性的分析、功能的发掘及Waxy种质的快速筛选等提供理论参考。【方法】设计特异引物从灌浆期间的奥地利黑麦籽粒cDNA中克隆获得Waxy,并进行体外表达;利用DuoFlow对籽粒蛋白提取物进行纯化,对峰值收集物、原核表达产物及其Ni柱纯化的重组Waxy蛋白进行SDS-PAGE分离,挖取蛋白条带进行MALDI-TOF质谱鉴定,结合经由基因序列所推导的氨基酸序列,确定回收产物的Waxy蛋白属性;在优化电泳条件的基础上构建针对Waxy蛋白的毛细管电泳体系;同时,利用部分黑麦品种对DuoFlow及CE体系的有效性进行验证。【结果】核苷酸序列分析表明,从奥地利黑麦cDNA中克隆获得一条覆盖Waxy全长的编码序列(GenBank登录号:KF559182),其理论编码产物约为60 kD;利用DuoFlow Q1阳离子交换柱,以低浓度Tris-Hcl(20 mmol·L-1Tris-Hcl,pH 9.5)进行蛋白挂柱,高浓度NaCl(20 mmol·L-1Tris+1 mol·L-1NaCl,pH 9.5)进行蛋白洗脱,214 nm波长检测,实现了对籽粒Waxy蛋白的DuoFlow高效分离;纯化产物的SDS-PAGE条带大小、质谱鉴定肽段与黑麦、小麦Waxy蛋白序列相似性的统计结果表明,DuoFlow峰值回收产物具有黑麦Waxy亚基一致的特征序列,故属于Waxy蛋白;以DuoFlow纯化产物为标准样,以0.05 mmol·L-1硼砂+15%乙腈+1%SDS溶液(pH 9.5)为缓冲液,采用分离电压20 kV,温度25℃,检测波长214 nm,压力进样,0.5 psi×5 s,在11—12 min处获得峰值约12 mAU单一主峰,图形清晰,基线水平,从而构建了Waxy蛋白的CE鉴定体系,且籽粒Waxy蛋白提取物能直接用于对该亚基的检测;同时,利用黑麦品种对上述体系的验证结果表明,DuoFlow及CE体系适于对Waxy亚基的高效分离与通量检测。【结论】从奥地利栽培黑麦cDNA文库中克隆获得Waxy完整编码序列,构建了能特异分离黑麦籽粒Waxy蛋白的DuoFlow制备级纯化体系,
- 孟敏董剑高翔赵万春李晓燕陈其皎陈良国石引刚
- 关键词：WAXY蛋白毛细管电泳
- 小麦Waxy蛋白亚基毛细管电泳分离体系的构建被引量：1
- 2015年
- 为构建Waxy蛋白亚基的快速、高效、高通量毛细管电泳分离鉴定体系,为该亚基理化特性的分析、功能的发掘及含Waxy蛋白亚基种质的快速筛选提供参考依据,以小麦中国春为材料,采用逐一优化毛细管电泳体系参数的方法,系统研究了毛细管电泳中缓冲液各成分以及pH值对中国春中Waxy蛋白亚基出峰效果的影响,初步构建了普通小麦Waxy蛋白亚基的最佳分离体系。结果表明,在检测波长为214nm、以0.05mol·L-1硼砂＋8%乙腈＋0.8%SDS溶液（pH 9.5）为缓冲液、分离电压20kV、温度25℃、进样压力0.5psi×5s时,在6~9min处出现峰高约0.015au的三个主峰,且图形清晰,基线水平,重复性好。本研究构建的毛细管电泳系统分离体系可有效分离普通小麦Waxy蛋白亚基。
- 孟敏强琴琴高翔陈其皎董剑
- 关键词：小麦WAXY蛋白毛细管电泳缓冲液
- 低分子量谷蛋白亚基在小麦品种形成过程中的变化特征被引量：1
- 2013年
- 【目的】研究普通小麦品种选育过程中低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)的变化特性,理解该基因家族成员多样性的起源,并为小麦品质改良提供参考。【方法】以3套小麦高代杂交品系(F5/F6)为材料,利用毛细管电泳(CE)技术从储藏蛋白水平鉴定LMW-GS亚基的变化;根据GenBank中已公布的LMW-GS编码序列设计特异性引物,进行PCR扩增、克隆、测序及序列分析。【结果】毛细管电泳结果表明,与亲本相比,高代供试品系均保持了相对稳定的LMW-GS数目,但多个亚基在籽粒中的最终含量却发生明显变化;同时,测试品系还产生了亲本所不具有的新条带。对克隆获得的54条序列(GenBank登录号KC222070-KC222121和KC478714-KC478715)进行序列分析,均具有LMW-GS的典型结构,包括相对保守的信号肽、存在丰富变异的中间重复区及保守的C-端,因此属于LMW-GS基因家族成员;子代与对应亲本的相似性分析表明,3套材料中均存在极端保守序列,子代序列与其相应父本序列完全一致,且都属于LMW-m型亚基;相对保守序列所占比例最大,由于微弱的SNPs,双亲都充当变异序列的供体;蛋白质序列分析还揭示了额外Cys亚基的产生过程。此外,还发现含10个或11个半胱氨酸(Cys)残基的LMW-GS。Cys残基的变异主要发生在C-端Ⅲ区,只有1条序列的Cys变异发生在C-端Ⅱ区。【结论】小麦品种选育过程,父源性的LMW-m型低分子量谷蛋白亚基较其它类型亚基更趋于序列的保守,SNPs则是产生LMW-GS多样性的主要动力。
- 杨芮高翔陈其皎李晓燕董剑孟敏赵万春石引刚陈良国
- 关键词：小麦毛细管电泳多样性
- 小麦品种陕253新型avenin-like的克隆与原核表达分析被引量：3
- 2010年
- 【目的】克隆小麦品种陕253中的新型avenin-like(类燕麦储藏蛋白),并构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。【方法】利用PCR方法从小麦品种陕253中克隆新型avenin-like,将克隆的avenin-like亚克隆至表达载体,经酶切及测序鉴定后,转化宿主菌Escherichia coli Rosetta-gami B(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,并利用Western blot进行检测。【结果】从小麦品种陕253克隆获得3个新avenin-like,GenBank登录号分别为GQ903577、GQ903578和GQ903579。序列分析表明,其中GQ903579为假基因,利用所构建的大肠杆菌表达载体,经IPTG诱导,实现了对登录号为GQ903578的基因在原核系统的特异性表达。【结论】新型avenin-like的克隆及原核表达的成功,为小麦品质改良提供了研究基础。
- 陈瑞佶高翔陈其皎董剑赵万春李艳亮王明霞李敏庞红喜李哲清刘俊
- 关键词：基因克隆融合蛋白原核表达
- 3份小麦品种(系)Gsp-1基因的克隆及序列分析被引量：1
- 2011年
- 根据已报道的谷类作物硬度基因grain softness protein-1（Gsp-1）保守DNA序列设计一对特异性引物,以优质小麦品种（系）中国春、SZ-56及M9876基因组DNA为模板进行基因扩增、克隆和序列测定,获得636 bp的Gsp-1全长特异性片段。序列分析显示其含有495 bp完整的开放阅读框,编码全长为164 aa的蛋白,该蛋白含有Gsp-1典型的19 aa信号肽,10个保守的半胱氨酸以及2个保守的色氨酸。序列比对表明,Gsp-1基因不仅含有Gsp-1 a、Gsp-1 b和Gsp-1 c这3种类型,还含有一种新的类型,将其命名Gsp-1 d。进一步对其结构预测分析发现,Gsp-1蛋白可形成5个链间二硫键,含有4~5个α-螺旋。进化树分析显示Gsp-1基因与硬度主效基因Pina和Pinb有着紧密关系。
- 李志业高翔陈其皎李晓燕董剑赵万春史红飞臧闻
- 关键词：小麦籽粒硬度克隆
- 六倍体普通小麦中国春PBF编码基因的克隆及序列分析被引量：2
- 2013年
- [目的]探讨作为模式小麦中国春PBF转录因子编码基因的多样性。[方法]以中国春小麦品种为材料,利用基因特异引物进行PCR扩增,经过胶回收,将目标片段连接至克隆载体上,随机选择阳性质粒测序。序列拼接与比对、信号肽预测、二级结构预测、亚细胞定位及系统演化进行分析分别经由DNAMAN、Signalp、PSIPRED、Nuc_PLoc及MEGA软件进行分析比对。[结果]从六倍体普通小麦中国春基因组中克隆得到25条编码序列,根据序列相似性,将其聚成3种等位类型,亚基2个位点存在SNP,且都导致编码氨基酸残基的改变,并影响到最终编码产物的二级结构。[结论]PBF亚基编码序列在中国春小麦中极端保守,但仍然存在变异。该结果为评价小麦籽粒储藏蛋白亚基的表达效率提供了理论参考。
- 郭丽娜高翔
- 关键词：普通小麦克隆
- 小麦品种“陕253”PDI基因的克隆、原核表达及蛋白纯化被引量：2
- 2011年
- 为进一步研究控制小麦蛋白二硫键形成的关键蛋白即蛋白质二硫键异构酶(PDI),运用RT-PCR方法克隆出小麦品种"陕253"PDI基因的cDNA序列,基因登陆号为HQ911363。序列分析表明,HQ911363全长为1 539 bp,编码512个氨基酸,含有PDI典型的异构酶活性的催化位点-CGHC-和内质网驻留信号肽-KDEL-。构建该基因的原核表达载体,在宿主菌E.coliBL21(DE3)中经IPTG诱导表达融合蛋白,并对表达蛋白进行了纯化。SDS-PAGE及Western-blot检测证实融合蛋白诱导表达并纯化成功。
- 臧闻董剑高翔陈其皎王延鹏李志业史红飞
- 关键词：小麦原核表达蛋白纯化
- 小麦avenin-like的克隆、原核表达与品质效应研究被引量：2
- 2012年
- 【目的】研究普通小麦不同品种的类燕麦贮藏蛋白(avenin-like)基因序列的多样性及其表达产物的加工品质效应。【方法】利用特异性引物对来源于不同地区的12个小麦品种(系)进行PCR扩增、克隆、测序及序列分析;构建JN542444原核表达载体后转入表达菌株Escherichia coli Rosetta gami B(DE3),IPTG诱导融合蛋白表达,并通过His-Trap HP柱纯化蛋白后进行微量掺粉试验。【结果】克隆获得22条avenin-like新基因序列(GenBank登录号JN542443—JN542464),长度均为855 bp,且均具有可编码284个氨基酸残基的完整的开放阅读框,无内含子;半胱氨酸数目及位置相对保守,除JN542452含有17个Cys外,其余avenin-like所编码的蛋白质序列均含有18个Cys,且位置相同,预测可能形成7个分子内二硫键和4个分子间二硫键;发现3条罕见的avenin-like假基因(JN542448、JN542455和JN542456),均因终止密码子的提前出现引起基因沉默;7份小麦品种共享一条avenin-like亚基,并与GenBank中来自普通小麦的HM027636完全一致,暂将该亚基命名为"Avenin-likeⅠ";系统演化分析表明avenin-like编码蛋白与LMW-GS关系最近,与ω-gliadin的亲缘关系最远;SDS-PAGE检测融合蛋白成功表达,对纯化蛋白进行微量掺粉试验,发现Avenin-likeⅠ型蛋白亚基对小麦加工品质具有显著的正向效应。【结论】avenin-like在供试小麦品种中具有很低的多态性,且Avenin-likeⅠ型亚基能提高面粉加工品质。
- 魏慧董剑陈其皎高翔王蕾李晓燕赵万春吴丹
- 关键词：小麦原核表达
- 簇毛麦新型低分子量谷蛋白亚基的分子克隆与序列分析被引量：2
- 2011年
- 为发掘低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)新的变异类型,通过设计引物和特异PCR扩增,从簇毛麦TA2127基因组DNA中得到14个LMW-GS基因,GenBank登录号分别为HQ615147～HQ615160。序列分析表明,所有基因具有完整编码区,长度为831bp和846bp,可编码277和282个氨基酸残基,推导的氨基酸序列分析显示,14个基因编码的蛋白序列都缺少一段N-端保守区,且N-端序列是一种新的类型;在14个LMW-GS基因中检测到19个SNPs和1个16bp的缺失。系统进化分析表明,簇毛麦LMW-GS与ω-醇溶蛋白和HMW-GS亲缘关系相对较远,与普通小麦Glu3-的低分子谷蛋白基因进化关系相对较近。
- 王延鹏高翔陈其皎赵万春董剑史红飞臧闻李志业李晓燕
- 关键词：LMW-GS进化关系
- 六倍体普通小麦中国春PBF编码基因的克隆及序列分析(英文)
- 2013年
- [目的]探讨作为模式小麦中国春PBF转录因子编码基因的多样性。[方法]以中国春小麦品种为材料,利用基因特异引物进行PCR扩增,经过胶回收,将目标片段连接至克隆载体上,随机选择阳性质粒测序。序列拼接与比对、信号肽预测、二级结构预测、亚细胞定位及系统演化分析分别经由DNAMAN、Signalp、PSIPRED、Nuc_PLoc及MEGA软件进行分析比对。[结果]从六倍体普通小麦中国春基因组中克隆得到25条编码序列,根据序列相似性,将其聚成3种等位类型,亚基2个位点存在SNP,且都导致编码氨基酸残基的改变,并影响到最终编码产物的二级结构。[结论]PBF亚基编码序列在中国春小麦中极端保守,但仍然存在变异。该结果为评价小麦籽粒储藏蛋白亚基的表达效率提供了理论参考。
- 郭丽娜高翔
- 关键词：普通小麦克隆
