国家高技术研究发展计划(2006AA02A224)
- 作品数：4 被引量：7H指数：2
- 相关作者：张振龙王健孙成金王恒李莉莉更多>>
- 相关机构：北京生物制品研究所北京协和医学院中国医学科学院北京协和医学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治专项更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 随机组合多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1蛋白的纯化及鉴定被引量：1
- 2011年
- 目的纯化随机组合多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1蛋白,并进行各项鉴定。方法对BL21(DE3)-M.RCAg-1/pDS-ex工程菌发酵产物进行纯化,对纯化的M.RCAg-1蛋白进行各种理化性质鉴定;采用Western blot法检测其反应原性;以不同剂量的M.RCAg-1蛋白免疫BALB/c小鼠及新西兰大白兔,采用间接ELISA法检测小鼠血清抗体效价;间接荧光免疫法(IFA)分析免疫血清对天然疟原虫抗原的识别;酶联免疫斑点试验检测特异性鼠T淋巴细胞的活化及细胞因子的分泌;体外生长抑制试验检测免疫兔血清对恶性疟原虫生长的影响。结果 M.RCAg-1蛋白表达量约为菌体总蛋白的30%,浓度为1.5 mg/ml,纯度可达95%左右,等电点为5.0;内毒素残留量均小于2.5 EU/mg,宿主蛋白残留量为0.08%,N-末端氨基酸序列正确;可与相应鼠单抗特异性结合;免疫小鼠血清抗体水平随着免疫次数和免疫剂量的增加而升高,20及30μg剂量组在末次免疫后,血清抗体滴度均可达1∶1 031 707;各免疫组小鼠血清均能识别恶性疟原虫天然抗原,且呈抗原剂量依赖性;10、20和30μg剂量组能刺激相应特异性脾淋巴细胞显著增殖(P<0.01)及分泌IFNγ和IL-4(P<0.01),并能较好地抑制疟原虫体外生长。结论纯化的M.RCAg-1蛋白理化性质稳定,具有较强的免疫原性,能激发可持续、高滴度的特异性抗体,并能诱发显著的T细胞应答,是极具潜力的候选疫苗蛋白,具有较好的开发前景。
- 王健孙成金李莉莉陈祥鹏李军王恒张振龙
- 关键词：疟疾疫苗
- 融合表达对人工重组多表位蛋白M．RCAg-1构象及免疫效能影响的研究被引量：1
- 2012年
- 目的研究载体融合肽段对人工重组多表位蛋白M．RCAg-1构象、免疫原性及体外保护性的影响。方法将人工多表位抗原M．RCAg-1基因通过不同的酶切位点克隆到原核表达载体pDS—ex上，从而获得带有不同载体融合标签或没有标签的蛋白，表达产物经纯化得到P312-1、P312—2、P312-3这3种多表位蛋白，利用生物信息学和色谱技术对制备的3种蛋白的二级及三级结构进行了分析，并将这3种纯度大于95％的重组蛋白与弗氏佐剂乳化后分别免疫接种小鼠和新西兰白兔，免疫后血清按常规进行ELISA间接法检测抗体滴度，采用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测分泌细胞因子的特异性淋巴细胞克隆数，同时进行了间接免疫荧光分析（IFA）以及对体外培养的恶性疟原虫的生长抑制试验（GIA）。结果P312—1、P312-2、P312-3这3种多表位蛋自在动物模型体内诱导的抗体滴度水平并无差异（P〉0．05），但蛋白免疫小鼠后却诱导了不同类型的T细胞反应，而且3种蛋白免疫血清IgG体外生长抑制率出现明显差异（分别为93．9％、14．7％、54．3％）。利用生物信息学和色谱技术分析，发现从不同表达载体制备的重组蛋白在二级和三级结构上出现极大差异，预测蛋白质分子的空间构象发生了改变，而且一些表位在分子中的位置也有明显的改变。结论不同的载体肽融合表达对多表位蛋白M．RCAg-1结构及免疫活性的影响会产生不同的作用，直接影响多表位蛋白的构象，进而会增强或抑制多表位蛋白的免疫效应。
- 王健蔺亚辉陈祥鹏李莉莉李军王恒张振龙
- 不同佐剂对随机组合多表位恶性疟疾疫苗M. RCAg-1的免疫原性及体外抑虫率影响的研究被引量：5
- 2011年
- 目的 研究弗氏佐剂及3种人用佐剂[Al（OH）3、Montanide ISA720、Montanide ISA51]对重组多表位蛋白M.RCAg-1（malaria random constructed antigen-1）在BALB/c小鼠及新西兰大白兔体内产生免疫效果的影响.方法 以弗氏佐剂、Al（ OH）3佐剂、Montanide ISA720以及MontanideISA51佐剂分别与M.RCAg-1蛋白进行配伍,分别免疫BALB/c小鼠及新西兰白兔；采用ELISA法检测M.RCAg-1蛋白及其所组成各个表位特异的血清IgG含量；间接荧光免疫试验分析不同配伍组免疫血清对天然疟原虫抗原的识别；酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测特异性鼠T淋巴细胞的活化；另借助生物传感器评价抗原与不同佐剂配伍组血清的亲和力,并用体外生长抑制试验（GIA）对恶性疟原虫的体外生长的影响进行评价.结果 不同佐剂可诱发不同水平的抗体滴度,Montanide ISA51佐剂配伍组的效果与弗氏佐剂组最为接近,并可使蛋白包含的11个表位肽能都较好诱发出特异性抗体,可有效激发以IFN-γ为主的细胞免疫应答,而且Montanide ISA51佐剂组免疫产生的抗体和M.RCAg-1蛋白质的亲和力高于其他两种佐剂；而Montanide ISA720佐剂和Al（OH）3佐剂免疫组不能诱发小鼠产生显著的IFN-γ反应（P＞0.05）.Montanide ISA51配伍蛋白质免疫产生的IgG在浓度为2mg/ml时对3D7和Dd2的抑制率分别为60%和100%,Al（OH）3佐剂组免疫兔血清IgG体外抑虫率较低（10%左右）,而Montanide ISA720佐剂免疫组血清不能有效抑制疟原虫生长.结论 通过比较3种人用佐剂和弗氏佐剂对BALB/c小鼠和新西兰兔的免疫辅助效能显示,Montanide ISA51佐剂能很好的辅助M.RCAg-1蛋白疫苗诱发动物体内的体液免疫和细胞免疫应答,可做为疫苗的候选佐剂之一.
- 王健蔺亚辉孙成金李莉莉陈祥鹏李军王恒张振龙
- 关键词：佐剂疟疾疫苗
- 多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1在大肠杆菌表达的条件优化和大规模培养被引量：2
- 2009年
- 通过以培养基配方、IPTG浓度、金属离子复合液浓度、镁离子浓度、表达时间、接种量、诱导时间点等发酵的重要条件对重组蛋白表达量影响的研究,确定多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1蛋白最佳表达条件为以改良TB培养基培养、最优Mg2+,诱导剂IPTG和金属离子复合液浓度分别为10mmol/L,0.5mmol/L,6μl/ml,接种量为10%,表达时间为4.5h,将优化后的参数用于50L发酵罐进行连续3批中试规模的发酵,最终收获菌体湿重平均为31.8±1.78g/L,目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的50%左右,试验确定了恶性疟疾多表位随机组合蛋白M.RCAg-1在大肠杆菌中的最优表达条件,该条件能够适合大规模培养需要。
- 孙成金王健丁军颖郭鹏郑凡张振龙
- 关键词：恶性疟疾大肠杆菌
