天津市卫生局科技基金(05KYZ60)
- 作品数：3 被引量：9H指数：2
- 相关作者：韩瑞发胡海龙孙岩吴长利张文岚更多>>
- 相关机构：吉林大学第一医院天津市泌尿外科研究所天津医科大学更多>>
- 发文基金：天津市卫生局科技基金天津市高等学校科技发展基金计划项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- siRNA沉默E2F3基因对人膀胱癌细胞的增殖抑制作用被引量：2
- 2010年
- 目的:探讨siRNA干扰E2F3基因对膀胱癌细胞(5637细胞)增殖的抑制作用,阐明E2F3基因沉默对5637细胞增殖抑制作用的生物学机制。方法:化学合成3对编码短发夹RNA序列的、靶向E2F3基因的寡核苷酸链,经BamHⅠ、HindⅢ双酶切克隆至pRNAT-U6.1/Neo系统,重组构建E2F3siRNA的RNAi质粒,以质粒转染DH5α菌株筛选得到稳定表达siRNA的细胞,转染5637细胞E2F3基因沉默,RT-PCR及Western blotting检测E2F3表达,流式细胞术检测5637细胞周期,采用Annexin-V/PS双染法检测细胞凋亡率。结果:RT-PCR及Western blotting检测干扰后5637细胞E2F3基因表达抑制,3条干扰序列对5637细胞周期抑制且G1期细胞比例增高,与阴性转染对照组比较差异有显著性(P<0.05和P<0.001);细胞凋亡率增加,与空白对照组及阴性转染对照组比较差异有显著性(P<0.001)。结论:siRNA干扰E2F3基因对膀胱癌5637细胞具有明显增殖抑制和促进凋亡的作用。
- 洪泉张文岚赵军傅耀文胡海龙韩瑞发
- 关键词：RNA干扰小分子干扰E2F3膀胱肿瘤细胞增殖抑制
- E2F3基因腺相关病毒干扰载体的构建被引量：4
- 2009年
- 目的:构建针对E2F3基因的腺相关病毒干扰穿梭质粒载体,为进一步包装能够表达干扰序列的病毒奠定基础。方法:通过已经合成的pRNAT-U6.1-siE2F3/Neo干扰质粒载体,进行限制性内切酶Mlu酶切,将干扰片段克隆入线性质粒pAAV-MCS中,构建具有表达沉默E2F3基因的RNA干扰穿梭质粒。通过Bgl Ⅱ及Mlu单酶切,BamH1和HandⅢ双酶切、PCR鉴定及基因片段序列分析验证构建是否成功。结果:pAAV-siE2F3线性化后,片段大小约6 300bp;以Mlu为两边酶切位点设计的引物对重组质粒进行PCR,可获得的产物大小1 700bp;应用ITR专用引物进行重组质粒的PCR后证实本研究所构建的重组质粒ITR片段存在,大小约3 500bp,上述指标均与预期设计结果相符。基因测序结果表明插入序列无基因突变,序列完整。结论:穿梭质粒载体的成功构建,为进一步包装能够表达针对E2F3基因干扰序列的腺相关病毒,进一步研究E2F3基因在肿瘤中的功能奠定基础。
- 胡海龙韩瑞发孙岩刘利维任海林梁恩利王春阳吴长利
- 关键词：RNAIE2F3
- pRNAT-U6.1/Neo系统在E2F-3基因RNA干扰载体构建中的应用被引量：5
- 2009年
- 目的:构建针对E2F-3基因的siRNA表达载体。方法:化学合成3对编码短发夹RNA序列的、靶向E2F-3基因的寡核苷酸链,各64个碱基,退火、克隆到经BamHI、HindⅢ双酶切的pRNAT-U6.1/Neo载体上,重组构建RNAi质粒。通过双酶切、PCR鉴定及基因片段序列分析验证构建效果。结果:重组构建的pRNAT-U6.1/Neo载体经PCR分析及插入基因片段序列分析,结果表明64个碱基成功插入到预计位点,并且序列完全一致,插入序列无点突变位点。结论:载体的成功构建为进一步研究E2F-3基因在膀胱肿瘤中的作用奠定了基础,为进一步以其为靶点进行膀胱癌细胞系体外实验创造了条件。
- 胡海龙吴长利孙岩张文岚韩瑞发
- 关键词：RNA干扰质粒
