国家自然科学基金(31160515)
- 作品数：6 被引量：13H指数：2
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- 结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B基因真核共表达载体的构建与表达(英文)
- 2013年
- 目的 Ag85A和Ag85B是结核分枝杆菌的主要优势保护抗原,为提高编码Ag85A和Ag85BDNA疫苗的免疫性和免疫效果,特构建真核共表达Ag85A和Ag85B抗原的真核表达载体pcDNA-Ag85A-IRES-Ag85B,并利用293T细胞其表达进行检测。方法 PCR扩增Ag85A和Ag85B基因,逐步将Ag85A和Ag85B基因定向插入至质粒pcDNA3.1(+)克隆位点CMV启动子与加A信号BGH poly(A)之间,并将Ag85A和Ag85B基因以内部核糖体进入位点(internal riboome entry site,IRES)序列连接,酶切和测序验证后将重组质粒转染至293T细胞中进行真核表达,48h后提取细胞总蛋白,达产物经SDS-PAGE分离和Western blot分析。结果限制性内切酶酶切及测序结果表明,重组质粒pcDNA-Ag85ARES-Ag85B基因序列和阅读框架正确。将重组质粒转入293T细胞后,利用Ag85A和Ag85B特异性抗体Western blot检测实两种抗原可在同一载体中各自独立表达。结论成功构建了能够同时独立表达结核分枝杆菌Ag85A和Ag85B抗原基的真核表达载体pcDNA-Ag85A-IRES-Ag85B,为下一步研究它们的免疫原性和免疫效果奠定了基础。
- 李武邓光存刘晓明王玉炯
- 关键词：结核分枝杆菌AG85AAG85B共表达WESTERNBLOT
- 肺泡上皮细胞减轻巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染中TLR信号介导的炎症反应被引量：6
- 2016年
- 本研究模拟体内肺泡的气液相环境,采用肺脏上皮细胞与巨噬细胞的气液相共培养模型,探讨肺脏上皮细胞对巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染的免疫调节作用。建立人肺泡上皮细胞A549与人单核细胞U937分化而来的巨噬细胞的气液相共培养模型,利用人结核分枝杆菌H37Rv株分别感染A549细胞、U937细胞和共感染A549/U937细胞,然后利用定量反转录PCR(qRT-PCR)、ELISA和Western blot检测巨噬细胞U937中的Toll样受体(TLR)信号分子及其下游炎症因子的表达变化。结果显示,H37Rv分别感染共培养模型中的A549细胞和U937细胞都能明显上调U937巨噬细胞中TLR信号分子TLR2、TLR4、TLR6、TLR8、MyD88和TRAF6,及其下游炎症因子NFκB、TNFα、IL-1α、IL-2、IL-6、IL-10和IL-12α的表达;但当H37Rv共感染上皮细胞和巨噬细胞,H37Rv诱导的U937巨噬细胞的上述因子表达较单独其感染的巨噬细胞显著下降。结果表明,在上皮细胞和巨噬细胞共培养体系中,结核分枝杆菌H37Rv分别感染人A549上皮细胞和U937巨噬细胞都能激发巨噬细胞的TLR信号及其下游的炎症反应,但2种细胞共感染H37Rv,上皮细胞感染后能够降低巨噬细胞的TLR信号活性,并减轻后者的炎症反应。由此可见,肺泡内上皮细胞与巨噬细胞之间可能存在某种相互调控机制,避免抗感染过程中的过度炎症反应以保持肺泡内细胞的组织及其功能的稳态。
- 孙颖飞杨易程龙贾元元任奇杰李勇刘晓明王玉炯
- 关键词：肺泡上皮细胞肺泡巨噬细胞炎症反应
- BCG初免-单次重组腺病毒Ad5-CEAB加强免疫策略的免疫效应研究（英文）被引量：1
- 2017年
- 目的为了评价BCG初免-单次重组腺病毒Ad5-CEAB加强的免疫策略诱导小鼠产生的免疫效应。方法在前期工作的基础上,制备并纯化获得了高滴度的重组腺病毒Ad5-CEAB,然后以小鼠为动物模型,采用BCG初免-Ad5-CEAB加强的异源初免-加强的免疫策略对动物进行免疫,通过测定小鼠淋巴细胞抗原刺激液中IL-12和IFN-γ的含量,测定小鼠血清IgG抗体含量以及小鼠肺盥洗液中sIgA的浓度来评价BCG初免-单次重组腺病毒Ad5-CEAB加强免疫策略的免疫效应。结果 BCG初免-Ad5-CEAB加强免疫后,经抗原刺激后的小鼠淋巴细胞会分泌高水平的IL-12和IFN-γ,这两种细胞因子的浓度均显著高于对照组。BCG初免-Ad5-CEAB加强后,还可以有效的刺激小鼠分泌IgG抗体,血清IgG抗体浓度显著高于对照组。另外,小鼠肺盥洗液中sIgA的浓度也显著高于对照组。结论采用BCG初免-单次Ad5-CEAB加强的异源初免-加强的免疫策略能够有效的刺激小鼠产生较强的免疫应答反应。
- 李武邓光存李敏刘晓明王玉炯
- 关键词：结核分枝杆菌重组腺病毒
- 结核分枝杆菌CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B抗原真核共表达载体的构建与表达被引量：3
- 2014年
- CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B是结核分枝杆菌的主要免疫优势抗原。为了构建一种可同时表达这4种抗原的真核多基因共表达载体pcDNA-CFP10-ESAT6-Ag85A-Ag85B(pcDNA-CEAB),并利用HEK 293T细胞对其体外表达进行检测。采用酶切、连接的方法,将CFP10和ESAT6编码基因以(Gly4Ser)3蛋白Linker连接,插入至质粒pcDNA3.1(+)多克隆位点CMV启动子与加尾信号BGH pA之间,使两者融合表达,将Ag85A和Ag85B编码基因以内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site,IRES)序列连接,并赋予RSV启动子和加尾信号BGH pA,使两者在RSV启动子作用下独立表达。重组质粒经酶切及测序验证后转染至HEK 293T细胞中进行体外表达实验,48 h后提取总蛋白,利用CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B特异性抗体进行Western blotting检测。结果显示多基因共表达载体pcDNA-CEAB在真核细胞HEK 293T中得到表达,且CFP10、ESAT6、Ag85A和Ag85B抗原能被相应的特异性抗体所识别,表明质粒pcDNA-CEAB构建正确,这为进一步研究其免疫原性和免疫保护效果奠定了基础。
- 李武邓光存刘晓明王玉炯
- 关键词：结核分枝杆菌蛋白免疫印迹
- 牛分支杆菌ag85b基因的克隆及表达被引量：1
- 2013年
- 以牛分支杆菌C68001株基因组DNA为模板,克隆免疫优势抗原基因ag85b,构建重组表达质粒pET-28a-ag85b,转化入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。结果表明,构建了ag85b基因的重组基因工程菌株,IPTG诱导表达的重组蛋白分子质量约为33ku,目的蛋白能被His单克隆抗体识别,表达产物主要以包涵体形式存在。
- 马玢曾瑾李武刘晓明邓光存
- 关键词：牛分支杆菌原核表达
