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携带TIMP-4 cDNA的重组腺病毒载体的构建: 2006年; 目的克隆细胞外基质金属蛋白酶组织抑制因子4(tissue inhibitor-4 of metalloproteinases,TIMP-4)基因,构建包装携带TIMP-4基因的重组腺病毒载体(Ad/T4),为基因治疗血管再狭窄的实验研究打下基础。方法以人心脏cDNA文库为模板,应用PCR克隆TIMP-4基因,经DNA测序确定克隆结果。构建具有强启动子CMV,携带TIMP-4和报告基因GFP的穿梭质粒pAdTrack-T4,利用AdEassy系统,在大肠杆菌BJ5183经同源重组产生重组腺病毒质粒pAd/T4。脂质体介导转染293细胞,包装重组腺病毒载体(Ad/T4)。结果克隆出含TIMP-4全部编码序列的cDNA片断,并通过亚克隆和同源重组等将其重组入腺病毒,构建包装了重组腺病毒载体Ad/T4。结论Ad/T4中含有TIMP-4和GFP的完整表达盒,可用于基因治疗的实验。; 米立国高英孟宪敏丁金凤; 关键词：金属蛋白酶类组织抑制剂腺病毒科基因

反义凝血酶受体和p21双基因共表达对损伤的大鼠颈总动脉的影响: 2001年; 目的 :观察反义凝血酶受体 (ATR)和 p2 1双基因治疗对WKY大鼠颈总动脉损伤后新生内膜的抑制效果 ,探寻基因治疗再狭窄的有效途径。　　方法 :将 42只雄性WKY大鼠随机分成基因治疗组 (导入rAAV/AP组 ,n =18)、载体对照组 (导入rAAV/GFP组 ,n =18)和正常对照组 (n =6 )。构建含有ATR和 p2 1双基因及含有绿色荧光蛋白 (GFP)基因的腺病毒伴随病毒(AAV)载体pSNAV/AP和 pSNAV/GFP ,用重组单纯疱疹病毒 (rHSV )生产体系包装重组腺病毒伴随病毒 (rAAV ) :rAAV/AP和rAAV/GFP。将rAAV/AP或rAAV /GFP导入拉伤的WKY大鼠的颈总动脉。分别于术后 2、 4、 6周取材 ,用半定量—逆转录多聚酶链反应和免疫组织化学方法检测凝血酶受体 (TR)和 p2 1在动脉壁中的表达。图像分析和统计学检验双基因的疗效。　　结果 :逆转录多聚酶链反应和免疫组织化学结果显示外源基因已导入血管壁的新生内膜和中膜并获得稳定表达。图像和统计学分析说明 :基因治疗后 2、 4和 6周 ,双基因治疗组 ( p2 1和ATR)的颈总动脉内膜厚度分别较载体对照组组内膜减少 5 9 2 %、 5 8 7%、 6 4 1%;中膜厚度分别减低 7 8%、 10 8%、 8 3%;中膜细胞密度减低 30 0 %、2 9 4 %、 2 6 2 %。　　结论 :ATR和p2; 米立国孟宪敏赵秀文刘冬青王学礼吴小兵丁金凤; 关键词：P21 基因治疗重组腺病毒血管成形术

CD/TK单、双自杀基因重组腺病毒的制备及初步应用被引量：1: 2002年; 为制备表达大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 (cytosinedeaminase ,CD)和单纯疱疹病毒 1 胸苷激酶(herpessimplexvirustype 1thymidinekinase ,TK)双自杀基因的重组腺病毒载体 ,为再狭窄基因治疗的应用奠定基础 ,首先构建了含单、双自杀基因的腺病毒穿梭载体 ,细菌内同源重组法获得重组腺病毒质粒 .脂质体介导下转染 2 93细胞进行包装并大量扩增得到Ad TK、Ad CD、Ad TK CD、Ad LacZ 4种重组腺病毒 .氯化铯 (CsCl)梯度离心法纯化后利用报告基因绿色荧光蛋白 (GFP)测定病毒滴度 ,可达 10 9pfu ml .PCR和Western印迹法对外源基因进行鉴定 ,证明单、双自杀基因均已整合入腺病毒基因组并表达 .重组腺病毒感染血管平滑肌细胞后 ,用MTT法比较了单、双自杀基因的杀伤作用 ,发现在感染复数≤ 2 0时 ,双自杀基因对细胞的抑制作用明显高于单基因 .成功地构建腺病毒双自杀基因共表达载体 ,为进一步的体内外实验奠定了基础 .; 曹慧青赵勇孟宪敏赵秀文刘冬青丁金凤; 关键词：双基因共表达自杀基因重组腺病毒

共表达胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶双自杀基因杀伤大鼠血管平滑肌细胞的机制研究被引量：2: 2004年; 目的 :研究共表达胞嘧啶脱氨酶 (CD)和胸苷激酶 (TK)双自杀基因对大鼠血管平滑肌细胞的杀伤机制。方法 :将表达CD和 (或 )TK的单、双自杀基因重组腺病毒载体分为 4组即Ad EF1α CD组、Ad CMV TK组、Ad EF1α CD CMV TK组和Ad lacZ组。感染原代培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞 ,感染复数为 2 0。给予相应的前体药物 5 氟胞嘧啶和脱氧鸟苷后 ,用四甲基偶氮挫盐微量酶反应比色法 (MTT)和流式细胞术分析细胞死亡率。荧光染料Hoechst 3 3 3 42核染色观察凋亡细胞。琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞基因组脱氧核糖核酸 (DNA)的降解。结果 :血管平滑肌细胞可被重组腺病毒有效感染 ( 70 % )。MTT检测发现Ad EF1α CD CMV TK组双自杀基因及其前体药物 [5 氟胞嘧啶 ( 3 0 μg/ml)和脱氧鸟苷 ( 0 3 μg/ml) ]的细胞毒效应可达 91% ,高于Ad CMV TK组 ( 68% )和Ad EF1α CD组 ( 63 % )单自杀基因组。流式细胞仪分析Ad CMV TK组和Ad EF1α CD CMV TK组的杀伤作用是以细胞毒性坏死和凋亡为主。凋亡细胞荧光染色显示Ad EF1α CD CMV TK组和Ad CMV TK组细胞的凋亡率分别为 11 0 %和 12 0 % ,高于Ad CMV LacZ组 ( 1 2 % )和Ad EF1α CD组 ( 5 0 % )。琼脂糖凝胶电泳发现在Ad CMV TK组和Ad EF1α CD CMV TK组的基因组DNA可?; 曹慧青孟宪敏刘冬青赵秀文丁金凤; 关键词：双自杀基因血管平滑肌细胞胸苷激酶胞嘧啶脱氨酶凋亡细胞共表达

反义TR和p21双基因共表达对人主动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的作用被引量：3: 2002年; 目的观察携带反义凝血酶受体(ATR)或/和p21的单、双基因重组腺病毒伴随病毒(rAAV)载体对人主动脉平滑肌细胞(ASMC)增殖与凋亡的影响。方法以携带ATR或/和p21的单、双基因rAAV感染人ASMC。半定量RT-PCR检测各基因的整合与表达;MTT法测定感染不同时间点的细胞存活率;流式细胞术检测细胞周期与凋亡细胞数目的变化;吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色检测凋亡细胞的比率。结果单、双基因在ASMC中均获得整合,且双基因发生了共表达;病毒感染4d时,ATR组、p21组和AP双基因组的细胞存活率与对照组相比分别降低了16.7%、21.6%和29.4%;三组的G0/G1期细胞数分别为(61.8±2.9)%、(82.5±4.0)%和(80.4±6.1)%;凋亡细胞数为(4.8±0.5)%、(5.7±0.1)%和(9.2±0.9)%;AO/EB染色显示的凋亡细胞比率分别为:对照组(1.5±0.8)%、ATR组(7.2±3.3)%、p21组(10.7±5.6)%、AP组(18.3±2.7)%。结论(1)双基因共表达对抑制细胞增殖和诱导凋亡的作用均较单基因具有较强的生物学效应。(2)为再狭窄的基因治疗提示了更优化的途径。; 孟宪敏米立国赵秀文曹慧青刘冬青高润霖丁金凤; 关键词：细胞增殖 P21基因共表达主动脉平滑肌细胞

双基因共表达在血管再狭窄研究中的应用被引量：7: 2003年; 目的　观察携带反义凝血酶受体 (ATR)和p2 1的双基因载体共表达后对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用 ,为再狭窄基因治疗寻求新途径。　方法　以携带ATR或和p2 1的单、双基因载体重组腺病毒伴随病毒(rAAV)感染培养的人主动脉平滑肌细胞 (hASMC) ,用半定量RT PCR检测各基因的整合与表达 ,MTT法测定病毒感染后不同时间点的细胞存活率。将携带AP双基因的rAAV导入WKY大鼠拉伤侧的颈总动脉 ,免疫组织化学法分别检测凝血酶受体 (TR)和p2 1两基因在动脉壁中的表达。　结果　RT PCR结果显示 ,TR单基因的mRNA表达降低 ,p2 1单基因表达升高 ,AP双基因得到了共表达 ;MTT法测定的生长曲线显示 ,双基因对hASMC增殖的抑制作用大于两个单基因 ;免疫组织化学证实 ,AP双基因导入后 ,TR基因的表达受到完全抑制 ,p2 1基因的表达明显增加 ,血管新生内膜与平滑肌细胞的增殖受到了抑制。　结论　ATR和p2 1双基因共表达在体外可明显抑制ASMC的增殖 ,在体内可明显抑制血管内膜新生和中膜的增生。; 孟宪敏米立国曹慧青赵秀文刘冬青高润霖丁金凤; 关键词：血管再狭窄 P21基因基因共表达平滑肌细胞

携带反义凝血酶受体和p21双基因共表达腺病毒伴随病毒载体的构建与包装: 2002年; 为探讨双基因共表达对再狭窄的防治作用 ,分别构建了含反义凝血酶受体 (ATR)或 /和 p2 1单、双基因及报告基因绿色荧光蛋白 (GFP)的腺病毒伴随病毒 (AAV)载体 .上述载体经脂质体介导转染BHK 2 1细胞 ,G4 18筛选获得整合有外源基因的细胞株 .克隆形成过程中显示单、双基因转染后细胞增殖受到了不同程度的抑制 ,克隆形成速度减慢 ,细胞形态改变 ,且双基因的作用明显大于单基因 .以绿色荧光出现说明报告基因得到表达后 ,又以DNA印迹证实ATR和p2 1单、双基因已整合于细胞基因组中 ,并维持了凝血酶受体 (TR)基因的反义位置 .半定量RT PCR证实TR基因表达降低 ,p2 1基因表达升高 ,ATR和p2 1(AP)双基因得到了共表达 .以具有可提供复制和包装功能的重组单纯疱疹病毒rHSV rc/ΔU12分别感染载有不同基因的BHK细胞株 ,包装产生重组AAV (rAAV)病毒 ,并经点杂交法测定其滴度 (每毫升病毒液中所含病毒颗粒数 ) .rAAV/AP中ATR与 p2 1的病毒颗粒数分别为 1 0 2× 10 13 /ml和 1 0 8× 10 13 /ml,单基因rAAV/ATR的滴度为 6 5 4× 10 12 /ml,rAAV/P2 1为 1 0 6× 10 13 /ml,为进一步的体内外实验奠定了物质基础 .; 孟宪敏吴小兵米立国伍志坚赵秀文刘冬青丁金凤; 关键词：共表达再狭窄

腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶/单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶双自杀基因对血管平滑肌细胞增殖的影响被引量：2: 2002年; 目的　观察构建的含胞嘧啶脱氨酶 /单纯疱疹病毒 - 1-胸苷激酶 (CD TK)双自杀基因的重组腺病毒对血管平滑肌细胞 (VSMCs)增殖的影响。方法　将含CD TK单、双自杀基因的重组腺病毒感染培养至 3～ 5代的大鼠VSMCs。荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白的数量确定感染效率。用MTT法检测前体药物对各转基因组细胞增殖的抑制作用。结果　单、双自杀基因组腺病毒均可 10 0 %感染VSMCs。当感染复数 (M O I)为 10时 ,双自杀基因组靶细胞的存活率仅 10 % ,明显低于腺病毒 (Ad) TK(43% )和Ad CD(6 4 % )单基因组 (P <0 0 5 )。当M O I≤ 2 0时双自杀基因能够对细胞产生最大 (90 % )杀伤而CD、TK单基因组和单基因共转染组则不能 ,而且双基因组所需前体药物的浓度 (无环鸟苷 0 1μg ml,5 氟胞嘧啶 10 μg ml)低于单基因组 (无环鸟苷 0 5 μg ml,5 氟胞嘧啶 5 0 μg ml)。双基因组的TK或CD基因单独作用时对细胞的抑制作用接近或低于相应的单基因组。结论　双自杀基因共表达腺病毒载体对VSMCs的抑制作用、安全性及可调控性均优于单基因。; 曹慧青孟宪敏赵勇赵秀文丁金凤; 关键词：腺病毒载体介导胞嘧啶脱氨酶单纯疱疹病毒-1 胸苷激酶自杀基因

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