国家高技术研究发展计划(2006AA02A252)
- 作品数：12 被引量：26H指数：4
- 相关作者：王颖梁米芳李川吴标孙丽娜更多>>
- 相关机构：上海交通大学中国疾病预防控制中心军事医学科学院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划上海市教育委员会重点学科基金“重大新药创制”科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 胞内抗体研究进展及临床应用前景
- 2012年
- 胞内抗体(intracellular antibody,intrabody)是一类在细胞内表达、特异性地靶向胞内抗原以期实现对相应功能的调节甚至阻断的新型基因工程抗体。最常见的胞内抗体形式为单链抗体(ScFv)。通过相应定位信号肽序列,胞内抗体能定位于胞浆、胞核、内质网、线粒体、高尔基体、细胞膜和过氧化酶体等各种细胞器,以实现对靶标抗原的功能性调控。其应用也由早先的干扰病毒复制和抑制肿瘤生长,逐渐拓展至治疗中枢神经系统退行性疾病、自身免疫病以及抑制免疫排斥等方面。本文对胞内抗体的作用机制、筛选策略、优缺点、应用及跨膜抗体作一综述。
- 吴标赵国屏王颖
- 关键词：胞内抗体单链抗体
- 基因组学时代的免疫学研究被引量：2
- 2008年
- 基因组学的研究成果为现代免疫学的发展提供了新的研究思路和策略.本文概述了基础免疫学、与疾病相关的免疫病理学及免疫疫苗的设计在高通量和大规模的基因组学研究策略支撑下获得的新进展,并探讨了其未来可能的发展方向.
- 李昊文王颖
- 关键词：基因组学免疫学免疫病理学疫苗设计
- 羊驼非免疫重链单域抗体库的构建和鉴定被引量：6
- 2011年
- 本研究旨在通过构建羊驼非免疫重链单域抗体库,完成抗体库多样性的鉴定,为进一步筛选抗原特异性重链抗体奠定基础。我们从未经免疫的羊驼外周血中分离外周血单个核细胞(PBMC),抽提RNA后,用RT-PCR方法特异性扩增羊驼重链抗体可变区(VHH)片段;并采用两步连接方法将重链抗体可变区片段与噬菌粒载体pCANTAB5E连接获得重组子,多次电转感受态大肠杆菌TG1后获得VHH抗体基因库;并采用稀释计数法测定抗体库库容量,随机挑取克隆测序验证抗体库多样性。结果显示,我们所构建的羊驼非免疫重链单域抗体库的库容量为1.5×109,随机克隆测序验证多样性良好,独立克隆所占比例为80%,并显示出和人源抗体较高的同源性。上述结果表明,我们已经成功构建获得大容量的羊驼非免疫重链单域抗体库,为进一步筛选抗原特异性重链抗体奠定基础。
- 吴标王树军夏立亮季萍葛海良赵国屏王颖
- 关键词：噬菌体展示羊驼
- 碳酸酐酶Ⅱ基因克隆及在毕赤酵母中的异源表达
- 2015年
- 碳酸酐酶Ⅱ(carbonic anhydraseⅡ,CAⅡ)是参与机体多种代谢活动和病理活动的一种重要催化酶。通过基因重组、电转化等方式,得到能异源高表达人CAⅡ的毕赤酵母(Pichia.pastoris)GS115工程菌。对工程菌进行培养及甲醇诱导后,经离子交换层析柱分离纯化后得到较纯的重组CAⅡ。通过Western blotting、酶活力及圆二色谱检测发现重组和商品化CAⅡ具有相似的酶活力和构象,为CAⅡ今后进一步在临床的研究和工业应用打下了基础。
- 卫玲赵莹徐晓晶
- 关键词：毕赤氏酵母异源表达
- 从人源全合成抗体库中筛选到抗人干扰素α1b单链抗体被引量：4
- 2009年
- 目的研究开发人源抗huIFN-α的基因工程抗体,为系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)的治疗提供有效的抗体药物。方法本研究利用噬菌体表面展示技术,以纯化的人干扰素α1b(huIFN-α1b)和人干扰素α2b(huIFN-α2b)蛋白为抗原从人源全合成抗体库中筛选抗huIFN-α的基因工程单链(single chain variable fragment,scFv)抗体,通过phage-ELISA对噬菌体单链抗体的结合特异性和稳定性进行验证。将单链抗体基因克隆到原核分泌表达载体pET22b上在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过Westernblot检测单链抗体的分泌表达,并通过ELISA对单链抗体的结合特异性进行验证。通过金属螯合亲和层析纯化单链抗体,并用WesternBlot对单链抗体的结合特异性进行鉴定。结果经过3轮富集筛选,获得100株对huIFN-α1b有特异性结合的噬菌体单链抗体。对得到的86株克隆的测序分析表明,共有9株带有不同的抗体轻重链可变区序列及其组合的抗体,有7株抗体轻重链可变区序列分类在VH3和VL3家族,有2株抗体轻重链可变区序列分类在VH3和VL1家族。获得了5株稳定且特异针对huIFN-α1b而与huIFN-α2b和huIFN-γ无交叉反应的人源单抗。这5株抗体在BL21(DE3)中分泌表达,有3株单链抗体能特异性结合huIFN-α1b而与无关抗原无交叉反应。结论通过噬菌体表面展示技术,从人源全合成抗体库中筛选得到3株稳定且特异结合huIFN-α1b的人源治疗用基因工程单克隆抗体。
- 龚斌王双李川王颖张全福陈哲孙丽娜梁米芳孙志伟李德新
- 关键词：干扰素I型单克隆
- 人源抗人干扰素α1b全抗体在昆虫细胞中的表达、纯化和鉴定
- 2012年
- 目的克隆、杆状病毒/昆虫表达系统表达人源抗人干扰素α1b（huIFN-α1b）全抗体基因,获得全抗体蛋白。方法利用PCR技术以gIII-scFv融合表达的噬菌粒质粒为模板,分别克隆了5株抗体基因的轻链和重链;经Nco I/Xho I和Sac I/Hind III分别酶切,与经过相同酶切的pAC-K-CH3载体连接构建了昆虫细胞sf9表达载体pAC-K-CH3-H-L;经测序鉴定正确后,转染进入昆虫细胞sf9进行异源表达。采用免疫荧光（IFA）和ELISA对全抗体的表达和结合情况进行初步鉴定。采用Protein-A亲和层析柱对收获的全抗体IgG蛋白进行纯化,将纯化后的抗体蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定。结果成功扩增了人源抗人干扰素α1b抗体轻链和重链基因;免疫荧光（IFA）鉴定表明5株重组质粒在昆虫细胞sf9表达出了全抗体蛋白,ELISA鉴定表明其中3株与huIFN-α1b特异性结合;经Protein-A亲和层析柱纯化后每升细胞培养上清收获了5~20 mg的蛋白,Western blotting鉴定表明3株纯化的全抗体蛋白和huIFN-α1b特异性结合。结论通过杆状病毒/昆虫表达系统获得了3株人源抗人干扰素α1b（huIFN-α1b）全抗体蛋白。
- 龚斌李川梁米芳
- 关键词：纯化
- 羊驼抗H5N1血凝素重链可变区-人IgGFc段嵌合抗体的制备和鉴定
- 2012年
- 本研究旨在制备羊驼抗H5N1禽流感病毒的重链抗体可变区-人Fc段嵌合体抗体制备,对所得嵌合抗体进行制备和功能鉴定,为临床应用奠定基础。用pET-22b表达载体构建抗H5N1禽流感病毒羊驼重链可变区(VHH)-人IgG1Fc嵌合基因,以包涵体形式表达VHH23-hFc嵌合抗体蛋白,采用优化的方法复性后,获得高纯度VHH23-hFc嵌合抗体,用ELISA法鉴定嵌合抗体亲和力、热稳定性和小鼠体内的半衰期。结果显示,透析复性后原核表达的抗H5N1禽流感病毒VHH23-hFc嵌合抗体亲和力为2.24×106 mol/L,具有较好免疫学活性,热稳定性也较好,小鼠体内半衰期达到35h,为下一步开展该抗体的体内外病毒中和试验奠定良好基础。
- 夏立亮吴标程亚庭蔡家麟王颖赵国屏
- 关键词：H5N1禽流感病毒重链可变区包涵体复性
- 全人源抗人干扰素α1b基因工程抗体与抗原的结合表位鉴定
- 2012年
- 目的鉴定抗原人干扰素α1b(huIFN-α1b)与1株全人源抗体蛋白AIFNa1IgG1的结合表位。方法从正常人分离纯化淋巴细胞并抽提mRNA进行CDNA合成,以CDNA为模板通过PCR扩增得到huIFN-α1b基因,通过重叠延伸PCR法构建huIFN-α1b蛋白29-35位氨基酸残基缺失突变体及点突变体,野生型和突变基因与载体pET30a连接构建重组表达载体,将以上重组表达载体转化大肠杆菌表达宿主E.coli Rosseta(DE3),诱导表达后的huIFN-α1b蛋白及突变体通过Western blot分析其与全人源抗huIFN-α1b基因工程抗体蛋白的结合活性。结果 huIFN-α1b蛋白在E.coli Rosseta(DE3)细胞中成功表达,Western-blot分析表明野生型huIFN-α1b蛋白与抗体结合,29-35位氨基酸缺失与抗体失去结合活性,其中27位的Ser,33位的Asp,34位的Arg,35的His,36位的Asp突变为Gly后,抗体与huIFN-α1b的结合可减弱到不可检测的水平。结论 huIFN-α1b蛋白29-35位氨基酸形成的表位是与抗体AIFNa1IgG1结合的重要表位。
- 龚斌梁米芳
- 关键词：抗体表位重叠延伸PCR
- 人源中和性抗高致病性禽流感病毒H5N1基因工程全抗体的研制被引量：3
- 2008年
- 运用噬菌体表面呈现技术,从禽流感病人恢复期血中获得淋巴细胞,通过基因工程手段,构建了人源抗H5N1禽流感病毒基因工程抗体文库。用纯化的人源H5N1禽流感病毒颗粒(A/Anhui/1/2005)及重组血凝素蛋白HA(A/VietNam/1203/2004)对Fab噬菌体抗体库进行富集筛选,成功地获得了抗禽流感病毒H5N1血凝素蛋白HA的人源单抗Fab段基因,并在大肠杆菌中获得有效表达。通过序列测定确定抗体轻重链型别,然后将阳性克隆的轻链和重链Fd段基因分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc后转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达。用ELISA、IFA和流式细胞术对所获人源单抗的功能特性进行鉴定。结果表明,我们获得了2株特异性针对H5N1禽流感病毒血凝素蛋白HA而与甲1型和甲3型人流感病毒无交叉反应的人源单抗(AVFluIgG01、AVFluIgG03)。微量中和试验结果表明,除A/Guangdong/1/2006外,AVFlu-IgG01能够广泛地中和HA基因进化上属于Clade2的中国南方、北方及中部地区的H5N1禽流感病毒分离株,同时还对属于CladeⅠ的越南H5N1分离株A/VietNam/1203/2004具有中和活性;AVFluIgG03虽然不能中和A/VietNam/1203/2004,但是对属于Clade2的所有中国H5N1分离株均具有中和作用。人源中和性抗禽流感病毒H5N1基因工程全抗体的获得不仅为高致病性禽流感病毒H5N1的预防和治疗带来了希望,同时也为其疫苗研制提供了新的思路。
- 孙丽娜刘琴芝王敏李川李梓胡晓芬朱莉莉李群王世文舒跃龙梁米芳李德新
- 关键词：禽流感病毒噬菌体表面呈现基因工程抗体FAB抗体
- 抗体重链可变区框架I区对抗体分泌的影响被引量：4
- 2008年
- 抗体重链可变区框架I区(FR-I)对抗体在原核细胞中的分泌表达具有显著的影响,单个氨基酸的改变即可导致抗体分子分泌能力的丧失。为了探索抗体在哺乳动物细胞中的高效表达,我们对一株不能有效分泌的人源抗狂犬病病毒抗体pCMV-RV/VH的FR-I区氨基酸编码基因进行定点突变研究。实验显示,抗体重链可变区FR-I区H6位的氨基酸由Glu突变为Gln之后,抗体的分泌表达水平得到了显著的提高,并且与抗原特异性结合的能力也明显增强。通过免疫荧光法对抗体在细胞内的转运过程进行了初步的探讨,发现能够有效分泌的抗体与无分泌表达的抗体都能够在细胞内进行正常的转录和翻译,进入内质网并转运至高尔基体,而且胞内表达水平基本一致。我们认为分泌能力的不同可能是FR-I区影响抗体分子的折叠与装配所致,其中该区H6位氨基酸的性质能够显著影响抗体在哺乳动物细胞中的分泌。本研究以抗体重链可变区FR-I区氨基酸为焦点,对基因工程抗体在真核细胞中高效表达的影响因素进行了探索,为改进抗体规模化生产提供了依据。
- 朱莉莉李川李建东孙丽娜梁米芳李德新
- 关键词：真核表达
