国家高技术研究发展计划(2006AA02A254) 作品数:10 被引量:14 H指数:2 相关作者: 马远方 沈倍奋 王辉 王琰 张学光 更多>> 相关机构: 军事医学科学院 河南大学 中国人民解放军海军总医院 更多>> 发文基金: 国家高技术研究发展计划 河南省杰出人才创新基金 国家自然科学基金 更多>> 相关领域: 医药卫生 更多>>
JNK信号传导通路在抗人DR5单克隆抗体mDRA-6诱导白血病细胞凋亡中的作用 2009年 目的:探讨JNK信号传导通路在抗人DR5单克隆抗体mDRA-6诱导白血病细胞Jurkat和U937凋亡过程中的作用。方法:MTT法检测mDRA-6对Jurkat和U937细胞的生长抑制作用;以Caspase抑制剂Z-VAD-FMK和JNK抑制剂SP600125进行干预,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术定量分析Jurkat和U937细胞凋亡;利用免疫印迹技术检测mDRA-6作用下凋亡细胞的JNK蛋白的表达情况。结果:mDRA-6对Jurkat和U937细胞具有明显的生长抑制作用;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测显示,10μg/ml的mDRA-6作用Jurkat和U937细胞3小时,其凋亡率分别为62.62%和35.65%,JNK抑制剂干预后细胞凋亡明显增加;免疫印迹技术检测显示,mDRA-6作用细胞5分钟后JNK即呈现活性片段表达,并随作用时间的延长其活性增强,而Caspase全抑制剂干预后,5、15分钟JNK磷酸化增强,但随后随时间递减。结论:mDRA-6抑制Jurkat和U937细胞生长并诱导其凋亡,其凋亡过程中有JNK的激活并发挥抗凋亡作用。 蔡静 李淑莲 王靖 王赟 袁艳军 蒋祺 秦方园 马远方关键词:JNK 白血病细胞 凋亡 抗体库技术中辅助噬菌体的研究进展 被引量:1 2008年 噬菌体抗体库作为噬菌体展示和抗体库2种技术的集合体,可以,奈需经过免疫而直接获取各种人源抗体,目前已广泛应用于生物学及医学等领域。在通常使用的噬菌粒系统中,使用野生型辅助噬菌体会导致“噬菌体污染”,使得仅有很少部分子代噬菌体带有抗体片段,这对抗体库的筛选工作非常不利。近年来,研究人员通过对噬菌体衣壳蛋白基因(g3)部分缺失、引入琥珀突变、构建新型辅助噬菌体或辅助质粒等策略,不仅有效避免了辅助噬菌体污染问题,使抗体展示效率提高了5~20倍,进而通过增加单价抗体展示在每个噬菌体表面,使抗原结合能力提高400倍,并且在第二轮筛选中即可得到有效富集(阳性克隆率超过50%)。本文综述了近年来应用在噬菌体抗体库的一些新型的辅助感染系统。 王辉 王琰 沈倍奋关键词:噬菌体抗体库 辅助噬菌体 大容量天然噬菌体抗体库的建立及多样性初步验证 被引量:2 2008年 目的:构建超大容量天然噬菌体抗体库。方法:从正常人外周血和新生儿脐血中分离淋巴细胞(>180份),提取RNA,用RT-PCR分别扩增抗体可变区轻重链基因(VH和VL),通过重叠PCR技术将VH和VL连接为单链抗体ScFv形式,克隆插入到pDF噬菌粒载体,转化XL1-Blue细菌得到ScFv初级抗体库,并以高感染复数(MOI≥100)感染Cre+菌株BS1365,利用Cre/LoxP位点特异性重组原理,使VH和VL基因定向同源重组匹配,随后以低感染复数(MOI<1)感染XL1-Blue,获取次级工作库。分别用5种不同抗原进行筛选,所获阳性克隆送测序以获取抗体基因。结果:抗体V区基因得到有效扩增,初级库库容3.6×107,工作库容1.8×1011,5种不同抗原筛选均得到特异性结合噬菌体抗体;测序结果表明,所获取抗体涵盖了不同的基因亚群,进一步证明抗体库具有良好的多样性。结论:经Cre/Loxp定位重组系统成功构建了超大容量天然噬菌体抗体库,初步尝试对5种抗原进行筛选均获成功,提示该抗体库多样性较好,可用于制备人源抗体。 王辉 黄英 王琰 沈倍奋关键词:噬菌体抗体库 CRE/LOXP重组系统 单链抗体 抗人CD40功能性嵌合抗体的制备及其高效表达 2010年 目的构建抗CD40嵌合抗体的真核表达载体,实现在真核细胞中的高效表达。方法采用RT-PCR法,从分泌鼠源抗人CD40抗体的杂交瘤细胞系5C11中钓取其轻、重链基因,进行序列测定。将5C11轻重链可变区基因分别克隆入表达载体pCMV-VH和pCMV-VL,构建成嵌合抗体(c5C11)的轻链真核表达载体5C11L-pCMV及重链真核表达载体5C11H-pCMV。将嵌合抗体的轻重链真核表达载体共转染入293T细胞,利用夹心ELISA法测定上清中c5C11的浓度,通过流式细胞术检测c5C11与膜抗原的特异性结合。通过生物信息学相关方法对c5C11的氨基酸序列进行合理改造,尝试在保持生物学功能的基础上提高c5C11的表达量。结果成功钓取鼠源单抗5C11的轻重链可变区基因并构建了真核表达载体,实现了c5C11的分泌表达;嵌合抗体较好地保留了鼠源母本抗体的抗原识别能力。利用计算机辅助设计,一定程度上提高了c5C11的表达量。结论为后续研究嵌合抗CD40抗体对B淋巴瘤等肿瘤的治疗提供了一定的依据。 化晓莉 乔春霞 黎燕 张学光关键词:CD40 杂交瘤 嵌合抗体 真核表达 正常人群中DR5天然自身抗体的分布特点及与肿瘤患者的差异分析 被引量:3 2010年 目的:探讨正常人群中DR5天然自身抗体的分布特点及与肿瘤患者的差异。方法:采用ELISA间接法检测正常人群与肿瘤患者血清中死亡受体5的天然自身抗体,并运用SPSS软件对其结果进行统计学分析。结果:正常人群中血清DR5天然自身抗体OD值平均值为0.39,在人群中呈近正态分布。正常人群血清DR5自身抗体OD值在不同年龄组之间存在显著性差异(P<0.05),随年龄增大而增高。相同年龄组之间,正常人群与肿瘤患者的血清中DR5天然自身抗体的OD值存在差异,肿瘤患者的OD值(0.17±0.014)小于正常人群的OD值(0.39±0.011),P<0.01。结论:我们发现人群中存在DR5的天然自身抗体,但平均滴度较低,符合生理性天然自身抗体的特点。正常人群血清中DR5的NAA水平随着年龄增加而增高,而肿瘤患者血清中DR5的NAA水平低于正常人群。提示在衰老的过程中,血清中DR5天然自身抗体的提高可能有助于清除恶变的细胞,施行肿瘤监视功能,阻止恶变细胞进展为肿瘤。 王艳鸽 李燕杰 都景芳 马远方关键词:死亡受体5 天然自身抗体 间接ELISA 抗人DR5功能性单克隆抗体诱导Jurkat细胞凋亡的线粒体途径的分子机制 被引量:1 2010年 目的:探讨抗人死亡受体5(DR5)功能性单克隆抗体(mDRA-6)对Jurkat细胞诱导凋亡的线粒体途径的分子机制。方法:MTT法检测单克隆抗体(mDRA-6)对Jurkat细胞生长抑制作用的剂量-效果及时间-效果关系;JC-1单染流式细胞术定量分析技术对凋亡的Jurkat细胞线粒体膜电位的变化进行分析;免疫印迹技术检测凋亡细胞的Caspase-8、3、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cytoc等凋亡相关蛋白的表达情况。结果:mDRA-6对Jurkat细胞抑制具有明显剂量-效果和时间-效果关系;流式细胞仪检测显示,2.0μg/ml浓度的mDRA-6作用15、30、60和120分钟时,Jurkat细胞线粒体膜电位改变率分别为20.14%、19.34%、21.11%、30.90%,呈逐渐增高趋势。免疫印迹技术检测显示,mDRA-6作用后,Jurkat细胞Caspase-8、9及Bid、Bax、Bcl-2、Cytoc等表达活性增加,并且Cytoc在线粒体内为递减而在胞浆呈递增的表达现象。结论:mDRA-6通过激活外源性膜受体,继而启动细胞线粒体途径导致Jurkat细胞凋亡。本研究为mDRA-6对白血病治疗奠定实验基础。 杜耀武 柴立辉 黄红莹 白慧玲 赵粤萍 马远方关键词:死亡受体5 单克隆抗体 JURKAT细胞 细胞凋亡 利用RLM-RACE克隆抗DR5单克隆抗体重链可变区基因 2010年 目的:克隆抗DR5单抗重链可变区基因。方法:使用Trizol从杂交瘤366EC提取总RNA,采用RLM-RACE进行抗体重链可变区基因的扩增。结果:扩增出一个800 bp的基因片段,与小鼠抗体重链可变区基因高度同源。结论:RLM-RACE是一种非常有效的扩增抗体重链可变区基因的方法。 刘峰涛 季泽俊 马远方关键词:可变区 死亡受体5 Characterization of a Novel Anti-DR5 Monoclonal Antibody WD1 with the Potential to Induce Tumor Cell Apoptosis 被引量:4 2008年 TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is a TNF family member capable of inducing apoptosis. Death receptor 5 (DR 5) is a key receptor of TRAIL and plays an important role in TRAIL-induced apoptosis. To prepare monoclonal antibodies (mAbs) against DR5,cDNA encoding soluble DR5 (sDR5) was firstly amplified by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) with specific primers,and then inserted into a prokaryotic expression vector pET-30a. The recombinant plasmid was expressed in Escherichia coli strain BL21 (DE3),and sDR5 was purified by nickel affinity chromatography. As an antigen,sDR5 was used to immunize mice. Hybridomas secreting antibodies against sDR5 were identified. One positive clone was selected to produce antibody,WD1. ELISA and immunofluorescence demonstrated that WD1 could bind recombinant sDR5 and membrane-bound DR5 (mDR5) on Jurkat and Molt-4 cells. ATPLite assays showed that Jurkat and Molt-4 cells were sensitive to the antibody in a dose dependent manner. The Annexin V/PI assays and Giemsa's staining both showed that WD1 could induce Jurkat cell apoptosis efficiently. Transient transfection of 293T cells and indirect immunofluorescence assay demonstrated that mAb (WD1) couldn't cross-react with DR4. Our findings indicated that the novel antibody,WD1 could act as a direct agonist,bind DR5 characteristically,and initiate efficient apoptotic signaling and tumor regression. Thus,WD1 would be a leading candidate for potential cancer therapeutics. Jing Wang Zhou Lin Chunxia Qiao Ming Lv Ming Yu He Xiao Qingyang Wang Liyan Wang Jiannan Feng Beifen Shen Yuanfang Ma Yan Li关键词:单克隆抗体 免疫系统 蝶酸对天然蓖麻毒素及重组蓖麻毒素A链蛋白的拮抗作用研究 被引量:1 2010年 目的研究蝶酸(pterinacid,PTA)对天然蓖麻毒素(ricin)及重组蓖麻毒素A链蛋白(rRTA)的拮抗作用。方法用无细胞体系中荧光素酶合成抑制实验和体外细胞毒性实验评价PTA对全分子ricin和rRTA的拮抗效果。结果PTA在两种体系中均显示出了对ricin和rRTA的拮抗作用,且呈剂量依赖性。结论利用PTA作为小分子探针,建立了针对ricin/RTA小分子抑制剂的体外生物学评价系统,为以后用于拮抗ricin/RTA的全新小分子化合物筛选奠定了基础。 曹曦元 赵青 黎燕 沈倍奋 王玉霞 冯健男 彭晖关键词:蓖麻毒素 抑制剂 125^I标记抗人CD40 mAb 5H6在荷人卵巢癌(HO8910)BALB/c裸鼠体内分布及放射免疫显像 被引量:2 2008年 目的:研究125I标记抗人CD40单克隆抗体(mAb)5H6同卵巢癌细胞HO8910体外结合的生物学特性以及在荷瘤鼠体内的分布和放射免疫显像。方法:氯胺-T法进行mAb 5H6 125I标记(125I-5H6),Lindmo法计算125I-5H6的免疫活性分数;细胞结合饱和实验进行Scatchard分析计算解离常数Kd及最大结合位点数Bmax;建立荷人卵巢癌(HO8910)裸鼠模型,分析125I-5H6在体内的分布,并用SPECT进行放射免疫显像。结果:mAb 5H6标记率为(85.4±5.2)%,放射化学纯度为(99.2±0.5)%,125I-5H6免疫活性分数为(38.6±5.4)%,与HO8910细胞的亲和力Kd=(0.711±0.06)nmol/L。在荷瘤鼠体内特异性结合HO8910肿瘤,48小时达到高峰,放射免疫显像肿瘤清晰可见。结论:125I-5H6同卵巢癌HO8910细胞在体外结合具有很高亲和力,在体内能特异性结合HO8910肿瘤,能获得优质的放射免疫图像。 罗先富 章斌 马泓冰 汤琳 郑舒丹 徐耀瑜 吴翼伟 张学光关键词:CD40 放射免疫显像 卵巢癌