国家自然科学基金(30370052)
- 作品数：5 被引量：40H指数：3
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- 猪圆环病毒2型ORF4基因编码蛋白的体外表达被引量：14
- 2008年
- 为了探讨猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF4基因结构及其所编码蛋白在PK15细胞中的表达特性,以PCV-2杭州株病毒DNA为模板进行PCR,结果扩增出了ORF4基因,并分别构建了pGEX-4T-1-ORF4原核表达载体和pEGFP-C2-ORF4真核表达载体。序列分析、SDS-PAGE分析和Western-blot检测表明,PCV-2 ORF4基因长180 bp,共编码60个氨基酸;其编码蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式存在,分子质量大小约为6.685 ku。真核PK15细胞的转染试验显示,ORF4重组蛋白在PK15细胞的细胞核和细胞浆中均有表达,但对其有一定的毒性。
- 李增魁陈婷飞李益飞周继勇
- 关键词：猪圆环病毒2型原核表达真核表达纯化
- 猪圆环病毒1型和2型Rep蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化被引量：2
- 2007年
- 分别以猪圆环病毒1型基因组和重组质粒pCI-PCV2-ORF1为模板,利用PCR扩增了猪圆环病毒1型和2型的ORF1基因,随后克隆到pET-28a(+)和pET-32a(+)两种原核表达载体上。测序正确的重组质粒分别转化E.coli BL21(DE3),进行目的蛋白的诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,猪圆环病毒1型和2型的ORF1均能在pET-28a和pET-32a中分别以重组蛋白His-Rep(40 Ku)和Trx-His-Rep(54 Ku)的形式表达。进一步纯化后测定重组蛋白的浓度,推算出猪圆环病毒1型和2型的His-Rep蛋白产量分别为34 mg/L菌液和14 mg/L菌液,Trx-His-Rep蛋白产量则为12 mg/L菌液和10 mg/L菌液。这些纯化的蛋白在Western blot中能够与猪抗猪圆环病毒2型阳性血清发生特异性反应,显示其具有良好的免疫学活性。本研究建立的猪圆环病毒重组Rep蛋白的原核表达系统及其纯化方法,为下一步开展Rep蛋白功能等相关研究奠定了基础。
- 李益飞申会刚商绍彬陈庆新郭军庆周继勇
- 关键词：REP蛋白纯化
- 猪圆环病毒2型HZ0201株分子克隆的感染性分析被引量：5
- 2007年
- 通过PCR扩增猪圆环病毒2型HZ0201株的全长基因组,克隆到pBluescript SK+载体SacⅡ位点;同时以SacⅡ切出PCV2全长DNA,并进行自身环化,分别构建PCV2全长基因组重组质粒和首尾相接的环化DNA。利用脂质体分别将PCV2重组质粒和环化DNA转染PK-15和Vero细胞,免疫组织化学试验(IHC)结果显示二者均检出PCV2阳性抗原。其中PCV2环化DNA转染细胞的阳性率显著高于PCV2重组质粒。将转染细胞进行连续8次传代,以IHC对每代病毒检测表明,PCV2分子克隆在PK-15细胞中形成的病毒能稳定感染,并且滴度逐步增加;而在Vero细胞上复制能力不强,传到第四代即不能检出病毒。
- 陈婷飞周继勇陈庆新商绍彬
- 关键词：猪圆环病毒2型分子克隆
- 猪圆环病毒2型ORF5编码非结构蛋白的表达
- 2009年
- 【目的】探讨猪圆环病毒2型(PCV-2)中ORF5所编码非结构蛋白(NS)的功能。【方法】根据Gen-Bank已发表PCV-2基因组序列设计特异引物,分别以HZ0201株(AY188355)、美国98-15237株病毒DNA为模板,采用PCR法扩增PCV-2ORF5基因,并构建了pGEX-4T-1-ORF5原核表达载体和pEGFP-C2-ORF5真核表达载体,对ORF5重组蛋白进行SDS-PAGE电泳、Western blot分析,用真核表达载体pEGFP-C2-ORF5转染PCV-2易感细胞PK-15。【结果】PCV-2ORF5基因长162bp,编码54个氨基酸;其所编码蛋白在E.coli中以包涵体形式存在,分子质量大小约为32ku。【结论】PCV-2ORF5编码重组蛋白在真核PK-15细胞中成功表达。
- 李增魁李英
- 关键词：猪圆环病毒2型ORF5基因原核表达真核表达
- 猪Ⅱ型圆环病毒浙江株的分离及全基因组结构分析被引量：19
- 2004年
- 用PCR方法对从浙江省猪场收集的、以淋巴结肿大和生长迟缓为特征的患猪腹股沟淋巴结进行PCV2检测。将检测为阳性的病料研磨、离心、过滤除菌后 ,接种PCV freePK 1 5细胞进行病毒分离 ,分离获得 3株病毒 ,命名为HZ0 2 0 1、HZ0 2 0 2、NB0 30 1。PK 1 5细胞增殖所得病毒离心纯化后 ,在电镜下可观察到直径约为 1 7～ 2 0nm ,呈二十面体对称的病毒粒子。以组织和病毒的细胞DNA为模板进行PCV2的全基因扩增 ,测序结果显示 ,3株病毒分离物全基因序列均由 1 76 7bp组成 ,直接来自病料与细胞分离毒株的核苷酸同源性为 1 0 0 %。基因组内含有 1 1个ORF。通过比较发现 ,分离毒株与PCV2参考株的同源性介于 94 2 %～ 99 7%之间 ;与PCV1参考株的同源性为77 2 %～ 77 9%。
- 陈庆新周继勇叶菊秀申会刚陈婷飞
- 关键词：猪圆环病毒2型基因结构PCV2
