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国家重点基础研究发展计划(2009CB118704): 作品数：17 被引量：48H指数：5; 相关作者：简纪常吴灶和闫秀英谢吉国鲁义善更多>>; 相关机构：广东海洋大学仲恺农业工程学院广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室更多>>; 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家自然科学基金广东省科技计划工业攻关项目更多>>; 相关领域：农业科学生物学更多>>

Antigenic analysis of grass carp reovirus using single-chain variable fragment antibody against IgM from Ctenopharyngodon idella被引量：5: 2013年; Grass carp (Ctenopharyngodon idella) is an important species of freshwater aquaculture fish in China. However, grass carp reovirus (GCRV) can cause fatal hemorrhagic disease in yearling populations. Until now, a strategy to define the antigenic capacity of the virus's structural proteins for preparing an effective vaccine has not been available. In this study, some single-chain variable fragment antibodies (scFv), which could specifically recognize grass carp IgM, were selected from a constructed mouse na ve antibody phage display cDNA library. The identified scFv C1B3 clone was shown to possess relatively higher specific binding activity to grass carp IgM. Furthermore, ELISA analysis indicated that the IgM level in serum from virus-infected grass carp was more than two times higher than that of the control group at 5-7 days post infection. Moreover, Western blot analysis demonstrated that the outer capsid protein VP7 has a specific immuno-binding-reaction with the serum IgM from virus-infected grass carp. Our results suggest that VP7 can induce a stronger immune response in grass carp than the other GCRV structural proteins, which implies that VP7 protein could be used as a preferred immunogen for vaccine design.; CHEN CongLinSUN XiaoYunLIAO LanJieLUO ShaoXiangLI ZhouQuanZHANG XiaoHuaWANG YaPingGUO QionLinFANG QinDAI HePing; 关键词：草鱼呼肠孤病毒抗原性分析可变区 VP7基因 CDNA文库

罗非鱼无乳链球菌DNA疫苗的构建及免疫效果研究被引量：5: 2013年; 为研究罗非鱼源无乳链球菌重组DNA疫苗对鱼体的免疫保护作用,将Sip基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)构建重组质粒pcDNA-Sip,并以肌肉注射方式免疫吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)。免疫后第7、28天取样,采用PCR及RT-PCR方法检测pcDNA-Sip在各个组织(包括肌肉、脾脏、头肾、鳃及肝脏)中的表达情况;分别于免疫后第7、14、21、28天采集血清,使用ELISA方法检测抗体效价;免疫28d后进行攻毒实验,计算疫苗的免疫保护率。结果表明,重组质粒pcDNA-Sip可以在上述各组织中被检测到;免疫21d后抗体效价出现峰值达1∶5 120;免疫保护率为90%。由此证实,pcDNA-Sip重组质粒可以转染到罗非鱼组织细胞,并可在鱼体中持续表达,同时有较高的免疫保护率。; 王蓓简纪常蔡双虎黄郁葱汤菊芬吴灶和; 关键词：无乳链球菌免疫罗非鱼

草鱼白细胞介素6基因克隆与表达分析被引量：1: 2013年; 白细胞介素6(IL-6)是一个多效的细胞因子,在机体免疫应答、急性期反应以及造血调控等过程中发挥着重要作用。以草鱼(Ctenopharyngodon idella)为研究对象,采用RT-PCR和Smart RACE技术克隆获得草鱼IL-6(CiIL-6)cDNA序列,CiIL-6的cDNA全长为1 145 bp,包含一个长为702 bp的开放阅读框,能编码233个氨基酸,预测CiIL-6的蛋白质分子质量为26.74 ku,等电点为8.72。其中5'和3'非编码区(UTR)分别为86 bp和357bp。氨基酸同源性分析显示,草鱼和斑马鱼(Danio rerio)的亲缘关系最近,它们的CiIL-6氨基酸同源性高达76%,而与其他物种的同源性均低于30%。RT-PCR的结果显示,CiIL-6在健康草鱼的胸腺、头肾和脾脏表达最高,而在鳃、胃和心脏中的表达量最低。; 颜鹏简纪常吴灶和; 关键词：草鱼白细胞介素6 基因克隆基因表达 RACE

草鱼呼肠孤病毒vp5基因诱饵重组载体的构建、转化与自激活作用检测被引量：6: 2012年; 根据草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)的vp5基因设计特异性引物,并扩增其开放阅读框序列(open reading frame,ORF),然后连接至pGBKT7载体上构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-vp5,转化至酵母菌Y2HGold,并进行PCR鉴定以及自激活性和毒性检测。PCR、酶切以及测序表明,pGBKT7-vp5重组诱饵载体构建成功。自激活性和毒性检测显示,阳性重组菌株pGBKT7-vp5/Y2HGold和阴性对照菌株pGBKT7/Y2HGold在SD/-Trp平板上出现大小相一致的乳白色菌落,且在SD/-Trp/X-α-Gel、SD/-Trp/AbA+/X-α-Gel平板上生长出蓝色菌落,而在SD/-Trp/-Ade/-His无菌落出现。表明重组菌株pGBKT7-vp5/Y2HGold表达的融合蛋白激活了报告基因AUR1-C和MEL1,没有激活报告基因ADE2和HIS3并且对宿主菌无毒性。该重组诱饵载体可用于酵母双杂交系统进一步筛选cDNA文库中与其相互作用的蛋白。; 谢吉国闫秀英简纪常吴灶和; 关键词：草鱼呼肠孤病毒酵母双杂交系统诱饵载体

草鱼呼肠孤病毒096 vp4基因生物信息学分析及其在肾细胞中的表达被引量：1: 2015年; 克隆得一株新分离病毒草鱼呼肠孤病毒(GCRV)096的长为1 981 bp的vp4基因,分析该基因的生物信息及其编码蛋白的特性。生物信息学分析表明,同一基因型GCRV分离株vp4基因间的差异不大,但不同基因型GCRV分离株vp4基因间却存在很大的差异。GCRV 096 VP4蛋白含有多个功能位点、2个跨膜结构域及多个潜在的抗原决定簇。构建p EGFP-N3-VP4真核表达质粒,并转染至草鱼肾(Ctenopharyngodon idellus kidney,CIK)细胞中,经荧光显微镜观察和Western blot鉴定,表明GCRV 096 VP4融合蛋白在CIK细胞中得以成功表达。; 闫秀英郭定利郑树城王雅谢吉国简纪常吴灶和; 关键词：草鱼呼肠孤病毒 VP4基因生物信息学真核表达

草鱼NCCRP-1和IL-10的表达、抗体制备及组织病理变化被引量：2: 2021年; 【目的】制备草鱼(Ctenopharyngodon idella)非特异性细胞毒性细胞受体蛋白-1(NCCRP-1)和白细胞介素-10(IL-10)的抗血清,探讨重组NCCRP-1和IL-10免疫在草鱼抗病毒感染过程中肾脏和肠病理学变化及对NCCRP-1和IL-10表达的影响。【方法】应用PCR扩增技术获得草鱼NCCRP-1和IL-10开放阅读框ORF,构建原核表达载体pET-NCCRP和pET-IL10;用表达的重组蛋白分别制备兔抗NCCRP-1和IL-10的抗血清,并采用ELISA方法测定抗血清的效价;分别用重组NCCRP-1和IL-10免疫草鱼,并用草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)GD108攻毒,感染7 d后制备草鱼肾脏和肠的病理切片,用定量PCR和western blot检测NCCRP-1和IL-10的表达。【结果】草鱼NCCRP-1和IL-10的ORF分别编码237个和179个氨基酸;草鱼NCCRP-1和IL-10的原核表达载体pET-NCCRP和pET-IL10在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中成功诱导表达,最优表达条件分别是0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)37℃诱导4 h和1.0 mmol/L IPTG 37℃诱导6 h,western blot分析表明重组表达的蛋白为目的蛋白;制备兔抗NCCRP-1和IL-10抗血清的效价均高达1∶40000,免疫和攻毒后,NCCRP-1免疫组草鱼肾脏与肠的病理变化较轻,且NCCRP-1在肾脏与肠中的表达量显著上调(P<0.05);IL-10免疫组草鱼肾脏与肠的病理变化较重,IL-10在肾脏与肠中的表达量变化不显著。【结论】外源性NCCRP-1免疫后增强了草鱼抵御GCRV-GD108感染的免疫应答,NCCRP-1对草鱼抗GCRV GD108感染效果显著;而外源性IL-10免疫后,其对草鱼抗GCRV GD108感染效果不显著。; 陈静妮代礼平雷燕胡海浩黄鉴涛简纪常闫秀英; 关键词：草鱼白细胞介素-10 组织病理学

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)NCCRP-1基因的克隆和原核表达被引量：2: 2013年; 应用RACE PCR克隆了草鱼NCCRP-1基因。结果表明,NCCRP-1cDNA全长900 bp,开放阅读框为714 bp,编码237个氨基酸残基,预测分子量为27.3 kD,理论等电点为5.63。草鱼NCCRP-1具有NCCRP-1蛋白家族保守的功能区域,与鲤鱼该基因(Cyprinus carpioL.)的相似性为88%。将此基因定向插入原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-NCCRP后转化BL2(1DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE分析显示在47.8 kD处出现特异性蛋白条带,Western blot检测表明草鱼NCCRP-1融合蛋白成功表达。; 蔡佳代礼平王蓓汤菊芬黄郁葱鲁义善吴灶和简纪常; 关键词：草鱼克隆原核表达

草鱼免疫球蛋白IgM四聚体的分析鉴定被引量：6: 2012年; 草鱼（Ctenopharyngodonidellus）是我国重要的淡水经济鱼类之一。为了制备有效的抗各种病原体的疫苗，必须对草鱼的免疫应答分子进行分析。IgM是大多数真骨鱼类血清中都存在的一种免疫球蛋白，是主要的介导体液免疫应答的分子，也是有颌类脊椎动物进化过程中最先出现的免疫球蛋白。; 陈丛琳罗绍祥张晓华戴和平; 关键词：草鱼 IGM 四聚体

草鱼呼肠孤病毒096 vp7基因生物信息学分析及其酵母表达载体的构建被引量：2: 2014年; 草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)是草鱼出血病的病原。从患病草鱼体内分离到一株草鱼呼肠孤病毒GCRV 096,经反转录PCR,克隆得GCRV 096长度为855 bp的vp7基因,并分析该基因编码蛋白的特性。结果表明,同一基因型分离株VP7蛋白间的差异不大,但不同基因型分离株VP7蛋白间存在很大的差异。对GCRV 096 VP7蛋白生物信息学分析表明,信号肽位点位于20氨基酸处,且VP7含有4个潜在的抗原决定簇。构建GCRV 096 vp7基因的酵母表达载体p GBKT7-S10,并成功转化至酵母中。; 郑树城谢吉国王雅蔡双虎简纪常吴灶和闫秀英; 关键词：草鱼呼肠孤病毒 VP7基因生物信息学酵母表达载体

草鱼细胞系CIK酵母双杂交cDNA文库的构建及初步应用: 2014年; 旨在探索草鱼呼肠孤病毒与宿主细胞蛋白质间的相互作用,运用SMART技术构建了草鱼肾组织细胞系CIK(Ctenopharyngodon idellus kidney)的酵母双杂交cDNA文库。提取CIK细胞总RNA后,分离纯化mRNA,然后以mRNA为模板,反转录合成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR,扩增双链cDNA。利用SMART技术,通过同源重组的方法,在酵母株Y187中构建了草鱼CIK细胞全长cDNA文库。经检测,未扩增文库的转化率为1.6×105,文库容量为2.4×106,插入的双链cDNA片段的长度为250-2 000 bp,文库滴度为7×107 CFU/mL,重组率为98%,此文库具有良好的cDNA片段多态性和完整性。利用构建的CIK酵母双杂交文库,以草鱼呼肠孤病毒的VP7和VP5蛋白作为诱饵进行筛选试验,得到VP7相互作用蛋白的阳性菌落,未得到VP5相互作用蛋白的阳性菌落。草鱼CIK细胞酵母双杂交cDNA文库的构建为研究草鱼呼肠孤病毒与宿主细胞间的互作机制提供了重要研究工具。; 闫秀英谢吉国李杰丁燏吴灶和鲁义善简纪常; 关键词：酵母双杂交 CDNA文库

国家重点基础研究发展计划(2009CB118704)

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