国家自然科学基金(30900986)
- 作品数：11 被引量：17H指数：2
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- 甘蓝BYPASS1编码基因的克隆与表达分析被引量：2
- 2013年
- 通过双向电泳结合MALDI-TOF-TOF/MS质谱技术在甘蓝柱头内鉴定出1个受自花授粉诱导上调表达的BYPASS1蛋白(BPS1)。利用PCR技术扩增甘蓝BPS1基因的编码序列,序列分析结果表明:该基因没有内含子,开放阅读框为1059bp,编码352个氨基酸,蛋白质分子量为38.7kD。氨基酸同源性和系统发生树分析结果表明:甘蓝BPS1与拟南芥BPS1亲缘最近,氨基酸同源相似性达85%;与烟草BPS2关系较远。RT-PCR检测结果表明:甘蓝BPS1基因在开花前1～2d的花瓣、萼片、花药、柱头和叶片中均有表达,柱头中的表达量最高。实时荧光定量PCR分析结果表明:甘蓝柱头内BPS1表达水平在自花授粉后逐渐升高,异花授粉后柱头内BPS1表达水平先升高后降低再升高。
- 刘豫东高启国曾静张林成朱利泉任雪松王小佳
- 关键词：甘蓝自花授粉异花授粉
- 甘蓝两种SRK短截蛋白的体外表达及其与THL1作用检测被引量：1
- 2011年
- 为探明S–位点受体激酶(SRK)上与类硫氧还蛋白1(THL1)作用的氨基酸区域以及两者间作用方式,依据SRKE1上功能域分布构建了两种SRKE1短截体原核表达质粒pGEX-SRKE1A和pGEX-SRKE1B,分别在大肠杆菌BL21中获得了可溶性表达。通过体外孵育检测蛋白质相互作用的方法对SRKE1A、SRKE1B与THL1相互作用进行了检测,结果表明SRKE1A和SRKE1B均可与THL1结合,明确了THL1与SRK相互作用并不依赖于SRK激酶活性。两类SRK等位序列间比对结果表明Cys在两类SRK间的保守性存在明显差异,推测两类SRK材料亲和性的差异可能与Cys保守性不同有关。
- 高启国孙梓健韦静宜朱利泉王小佳
- 关键词：甘蓝
- 结球甘蓝AUX/IAA家族基因BoIAA2与BoIAA19的克隆与表达分析被引量：2
- 2017年
- 为了探究AUX/IAA家族基因在结球甘蓝叶片与茎尖发育过程中的功能,筛选出对甘蓝叶片与茎尖发育具重要影响的相关AUX/IAA基因。试验以结球甘蓝品系"519"为材料,通过对莲座期叶片与茎尖,结球期叶片与茎尖的转录组比较分析,筛选出在两个组织中均表达差异显著的2个AUX/IAA基因,分别为BoIAA2与BoIAA19。采用PCR技术分别获得基因BoIAA2与BoIAA19的编码序列,其CDS(coding sequence)全长分别为519 bp、585 bp,编码172、194个氨基酸;进一步序列分析发现BoIAA2、BoIAA19分别与大白菜BrIAA2、油菜BnIAA19氨基酸同源相似性均达99%,且均具有AUX/IAA蛋白的DomainⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ特异性结构域。利用荧光定量PCR分析表明BoIAA2和BoIAA19在叶片、茎尖中的表达量均呈现出结球期高于莲座期的变化趋势,与转录组分析结果相符;对其结合蛋白基因BoTIR1和BoARF8进行表达分析,结果显示二者与BoIAA2、BoIAA19在叶片、茎尖中不同时期的表达量变化趋势一致;由此,推测BoIAA2和BoIAA19可能通过与BoTIR1和BoARF8的结合影响生长素信号转导,进而调控结球甘蓝叶片及茎尖的生长发育。
- 蒲全明施松梅张林成高启国任雪松向承勇杨鹏林帮民耿明明
- 关键词：结球甘蓝AUX/IAA基因克隆
- 甘蓝转录因子BoLH27的克隆与转基因甘蓝的表型分析
- 2018年
- bHLH转录因子对植物生长发育、形态调控有重要作用,为了研究BoLH27基因在甘蓝叶片发育及形态建成中的调控功能,本文以甘蓝品种519为材料,克隆出转录因子BoLH27基因。序列分析表明,该基因含有一个795 bp的开放阅读框,编码264个氨基酸,具有一个保守的典型bHLH结构域。以农杆菌介导的遗传转化方法将正义BoLH27基因导入甘蓝品种519中以增强表达,通过PCR筛选出9株T0代转基因单株,结合T2代单株的q RT-PCR分析表明,筛选的转基因植株内BoLH27基因的表达积累量明显高于野生型。试验基地隔离网内种植的转基因甘蓝表型明显,主要表现为莲座期茎叶间距拉长、叶柄伸长以及植株茎和叶柄显示紫色,植株叶片平展,无向上向内卷曲趋势,表明BoLH27基因可能对甘蓝叶片发育有重要的调控作用。
- 梁云飞张林成蒲全明雷镇泽施松梅姜宇鹏任雪松高启国
- 关键词：甘蓝基因克隆转基因表型
- 结球甘蓝叶片卷曲过程中6个生长素相关基因的克隆与表达分析被引量：2
- 2015年
- 生长素在结球甘蓝球叶向上、向内自然卷曲的过程中发挥着重要的调控作用。为挖掘重要的影响结球甘蓝叶片卷曲的生长素相关基因,通过对结球甘蓝莲座期叶片与结球期叶片的转录组进行对比分析,筛选出6个显著差异表达的生长素相关基因,分别为调控生长素动态平衡的Bo ILL6、Bo ASA1基因,控制极性运输的Bo SF21、Bo PIN4基因,参与信号转导的Bo ARF8、Bo GH3.5基因。对上述6个基因进行同源克隆,分别获得全长c DNA序列,序列分析发现6个基因均含有生长素相关的结构域。分子进化树分析发现各基因与芜菁的对应基因遗传关系最近,拟南芥次之。荧光定量PCR检测结果显示,Bo ILL6、Bo ASA1与Bo SF21的表达量变化最为显著,结球期叶片相对莲座期叶片的表达量差异均高达12倍以上,变化趋势与转录组数据分析结果基本一致,说明这3个基因可能与结球甘蓝叶片的卷曲发育密切相关。
- 蒲全明高启国张林成施松梅刘晓欢张莹毕云龙任雪松刘豫东朱利泉
- 关键词：结球甘蓝基因克隆
- 甘蓝自交不亲和相关转录因子BosiP_(A1)蛋白基因的克隆与表达分析
- 2013年
- 通过自交不亲和甘蓝‘A1’自花授粉1 h和未授粉柱头蛋白质表达谱的对比,鉴定出1个受自花授粉诱导上调表达的蛋白,通过PCR技术获取了其编码序列,命名为BosiPA1蛋白,其基因全长为3 730 bp,具有1个1 092 bp的完整编码框(KF314579)。BosiPA1由6个外显子、5个内含子组成,编码363个氨基酸。序列分析表明BosiPA1蛋白具有典型的basic helix-loop-helix(bHLH)功能域,在SCR、SRK、Exo70A1基因的ATG上游启动子序列中存在可以被bHLH功能区识别并结合的E-box(CANNTG)序列。在分子进化上甘蓝BosiPA1与AtbHLH128距离最近,与AtHEC1/2/3和TgGBOF-1处在同一个分支。RT-PCR检测表明甘蓝BosiPA1基因在花瓣、萼片、花粉、柱头和叶片中均有表达;荧光定量PCR分析表明BosiPA1基因在自花授粉10 min、30 min、1 h的柱头中呈逐渐上升趋势。上述结果说明BosiPA1与bHLH的进化分支较早,可能是一个参与甘蓝多器官发育的自交不亲和相关的转录因子。
- 刘豫东朱利泉高启国曾静张林成任雪松王小佳
- 关键词：甘蓝基因克隆
- 甘蓝BoMLPKn1的克隆及其拟南芥同源基因AtAPK1b的功能研究被引量：1
- 2019年
- 在克隆甘蓝BoMLPK编码序列过程中,获得BoMLPKf1/2编码序列和1个新的转录文本(命名为BoMLPKn1)。BoMLPKf1/2和BoMLPKn1的c DNA大小分别为1215、1233和1257 bp,分别编码含404、410和418个氨基酸残基的多肽链。与BoMLPKf1/2相比,BoMLPKn1有两个插入序列,一个是在1102~1114 bp之间有12个碱基的插入,另一个是在1152~1182 bp之间有30个碱基的插入。BoMLPKf1/2定位在甘蓝3号染色体上,BoMLPKn1定位在4号染色体上。氨基酸序列比对发现,BoMLPKf1和BoMLPKn1的N端均含典型的豆蔻酰化基序,BoMLPKf2的N端含疏水结构域。3个转录文本均具有1个高度保守的Ser/Thr蛋白激酶结构域。RT-PCR检测发现自交不亲和甘蓝自花授粉15min后BoMLPKf2相对表达量急剧升高,BoMLPKf1和BoMLPKn1在自花授粉15 min后相对表达量无明显变化。亚细胞定位检测到BoMLPKn1定位在细胞膜上。利用CRISPR-Cas9植物编辑系统对BoMLPKn1拟南芥直系同源基因AtAPK1b基因组进行定点敲除,获得突变体植株。与野生型相比,突变体植株均能够正常开花结籽。结果表明MLPKn1基因在整个十字花科进化中是高度保守的,不参与自交不亲和反应,这与MLPKf1/2不同。
- 施松梅高启国高启国蒲全明刘豫东刘贵喜朱利泉朱利泉
- 关键词：甘蓝基因克隆亚细胞定位
- 自交不亲和甘蓝亲和花粉授粉早期差异蛋白质分析被引量：6
- 2013年
- 为从蛋白质的角度揭示自交不亲和甘蓝亲和授粉早期花粉与柱头相互作用,将蛋白质组学方法应用于自交不亲和性甘蓝柱头与亲和花粉互作早期差异蛋白质的研究。结果表明,亲和授粉后 3 ～ 5min 与 1 h 对比,有 116 个差异蛋白质点,而授粉后 1 h 与 2 h 差异不显著。按照特异表达与变化量大的蛋白质点优先原则,初步选取差异点中 71 个点做质谱分析,鉴定出 31 个可信差异蛋白质。与亲和授粉后 3 ～ 5 min 组相比,1 h 组中特异表达蛋白质有 19 个,上调表达 9 个,下调表达 3 个。31 种蛋白质的生物信息学分析表明,有两种蛋白与前人发现的与花粉管在柱头中生长发育相关蛋白相同,其他 29 种参与包括胁迫与防御应答在内多种生理过程。对早期差异蛋白中这种"既有促进花粉管发育的蛋白,也有与防御相关蛋白"现象分析表明,花粉管生长性侵入柱头的过程有可能伴随着柱头抗性的提高。
- 陈松曾静高启国朱利泉刘豫东任雪松王小佳
- 关键词：甘蓝授粉双向电泳
- 基于SRK和SCR序列的甘蓝自交不亲和系单倍型分析被引量：2
- 2011年
- 采用RT-PCR和其他分子生物学方法,以甘蓝自交不亲和系E1和F1柱头cDNA为模板扩增SRKE1和SRKF1基因,以花药cDNA为模板扩增SCRE1和SCRF1基因.经序列比对首次证明E1和F1材料分别为S28和S7单倍型.经三维结构分析,预测SCRE1上C5-C6和C7-C8之间氨基酸序列决定SCRE1的单倍型特异性,SRKE1上TNNSFYSRLKVS序列决定了SRKE1的单倍型特异性,并对两者相对作用的关键氨基酸位点进行了分析.
- 高启国韦静宜朱利泉王小佳
- 关键词：甘蓝自交不亲和性单倍型
- 甘蓝MLPK的原核表达及其互作蛋白分离体系的建立被引量：1
- 2015年
- M–位点受体激酶(MLPK)是甘蓝自交不亲和反应的正向调控关键元件,其参与自交不亲和反应的分子机制尚不明确。为了分离与MLPK相互作用的蛋白,在分析了MLPK功能域的基础上采用PCR技术扩增了MLPK激酶结构域编码序列(记为MLPKK),通过体外定点突变技术构建了两种MLPK失活突变体(记为mlpk1和mlpk2),然后以p ET43.1a为载体构建了原核表达质粒p ET43.1a-MLPKK、p ET43.1a-mlpk1和p ET43.1a-mlpk2,并进行了原核表达和纯化。纯化的融合蛋白p ET43.1a-MLPKK、p ET43.1a-mlpk1和p ET43.1a-mlpk2分别与高度自交不亲和甘蓝‘A4’柱头总蛋白提取液进行孵育,孵育后利用融合蛋白序列中的6×His标签与Ni+结合的特性,钓取MLPK的互作蛋白,建立了分离MLPK互作蛋白的新方法。孵育产物经SDS-PAGE电泳显示,与两个突变体蛋白泳道对比,在p ET43.1a-MLPKK与柱头总蛋白提取液孵育产物的泳道中成功获得了候选的与MLPK互作的蛋白条带,这为后续互作蛋白质谱鉴定以及功能解析提供了技术支持。
- 刘晓欢高启国施松梅蒲全明毕云龙张莹朱利泉王小佳
- 关键词：甘蓝自交不亲和
