国家重点基础研究发展计划(2012CB114406)
- 作品数：7 被引量：36H指数：4
- 相关作者：邢婧战文斌绳秀珍唐小千宋晓青更多>>
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- 迟缓爱德华氏菌感染和疫苗免疫后牙鲆的血细胞数量变化被引量：1
- 2017年
- 重组表达了牙鲆(Paralichthys olivaceus)T淋巴细胞表面标志分子CD3的蛋白,制备出其兔多克隆抗体(多抗),采用免疫双荧光流式细胞术,观察外周血白细胞中的T、B淋巴细胞并计算其比例。分别向牙鲆腹腔内注射107 CFU/mL的迟缓爱德华氏菌和其灭活疫苗,于0、1、3、5、7、9、14、21和28天后抽取外周血,用抗红细胞单抗的流式细胞术测定红细胞和白细胞的比例和浓度,提取外周血白细胞,用流式细胞术测定T、B淋巴细胞的比例。研究显示,CD3多抗和IgM单抗分别识别T、B淋巴细胞,二抗体无交叉反应,白细胞中T细胞占(7.49±1.5)%、B细胞占(14.64±1.8)%。感染和免疫后,牙鲆外周血红细胞浓度变化不显著,为(2.9±0.45)×10~9 cells/mL。感染组,白细胞浓度第3天显著上升,第14天达到最大值(4.7±1.7)×10~8cells/mL;T细胞比例第1天显著上升,第9天达到最大值(24.3±1.28)%;B细胞比例第1天显著升高,第21天达到最大值(40.9±1.52)%。免疫组,白细胞浓度第3天显著上升,第14天达最大值(7.1±1.8)×10~8cells/mL;T细胞比例第5天显著上升,第9天达最大值(20.5±1.12)%;B细胞比例第1天显著上升,第21天达到最大值(39.3±1.55)%。对照组,白细胞浓度为(6.9±1.6)×10~7cells/mL,T细胞比例为(8.05±1.38)%,B细胞比例为(13.77±1.56)%。研究结果表明,感染和免疫后牙鲆白细胞浓度、T、B细胞的比例均显著升高,感染组T、B细胞比例显著高于免疫组。本研究结果为血细胞作为牙鲆健康评估指标提供了数据资料。
- 甄梦晓邢婧绳秀珍唐小千战文斌
- 关键词：牙鲆免疫迟缓爱德华氏菌T淋巴细胞B淋巴细胞
- 牙鲆经注射和浸泡免疫鳗弧菌灭活疫苗后7种免疫相关基因表达的变化被引量：15
- 2014年
- 制备鳗弧菌（Vibrio anguillarum）全菌灭活疫苗,采用腹腔注射和浸泡两种方式分别免疫牙鲆（Paralichthys olivaceus）,于免疫后0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、7 d、14 d分别取牙鲆脾、头肾、鳃3种组织,提取mRNA,应用实时荧光定量PCR法检测3种组织中白介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子（TNF）α、主要组织相容性复合体（MHC）MCHⅠ、MHCⅡ、T细胞表面受体CD4、T细胞表面受体CD8、免疫球蛋白（Ig）M 7种免疫相关基因的表达。结果显示,两种方式免疫后各基因表达量均出现显著上调。注射组3种组织中, IL-1β、TNFα基因的表达高峰出现时间在12-24 h, MHCⅠ、MHCⅡ、CD4、CD8的表达高峰出现在48-72 h, IgM的表达高峰出现在免疫后7 d,各基因表达量最高值是对照组的2-70倍；浸泡组3种组织中, IL-1β、TNFα基因的表达高峰出现在免疫后12-48 h, MHCⅠ、MHCⅡ、CD8表达高峰出现在48-96 h,但CD4在头肾和鳃中表达高峰出现在72 h,在脾中表达高峰出现在7 d, IgM在鳃中表达高峰出现在96 h,在脾和头肾中表达量在14 d内逐渐上升,各基因表达最高值是对照组的2-20倍。结果表明,注射组各组织基因的转录水平均高于浸泡组,且脾、头肾中表达量最高值出现时间早于浸泡组,但鳃中各基因峰值出现时间晚于浸泡组。研究结果为疫苗的免疫途径及免疫效果评价提供了基础数据。
- 宋晓青邢婧战文斌
- 关键词：牙鲆注射免疫浸泡免疫免疫相关基因
- 利用鱼抗血清及鼠抗血清分析鱼肠道弧菌全菌蛋白抗原性被引量：2
- 2016年
- 从患腹水症牙鲆脾脏组织中分离得到一株优势菌株CD86,经人工感染实验证实菌株CD86对牙鲆有较高的致病力,其半致死浓度为1.8×105 CFU/尾。通过生理生化特征测定和16SrDNA基因序列分析,判定菌株CD86为鱼肠道弧菌(Vibrio ichthyoenteri)。以福尔马林灭活的菌株CD86全菌分别免疫健康的小鼠和牙鲆,ELISA测定鼠抗血清和牙鲆抗血清效价分别为12 800和1 200。利用间接免疫荧光技术检测2种抗血清与菌株CD86的结合活性,结果显示,2种血清均可同菌体发生阳性反应,其中鼠抗血清阳性反应信号明显强于鱼抗血清。同时,利用Western blotting分析了菌株CD86全菌蛋白的抗原性,结果显示分子量为27、30和37kDa的菌体蛋白条带与2种血清均发生阳性反应;分子量为19、25、28、29和35kDa的菌体蛋白条带仅与鼠抗血清发生阳性反应;分子量为45kDa的菌体蛋白条带只与鱼抗血清发生阳性反应。研究结果表明,牙鲆对菌体抗原产生的抗体应答与小鼠存在明显差异,该发现对研筛鱼用高效的鱼肠道弧菌亚单位疫苗具有重要的参考价值。
- 张铭伟唐小千绳秀珍邢婧战文斌
- 关键词：BLOTTING抗原性分析抗血清
- 大菱鲆mIgD重链基因的克隆与表达分析被引量：4
- 2014年
- 利用RACE技术克隆获得大菱鲆（Scophthalmus maximus）膜结合型免疫球蛋白D（Membrane-boundedIg，mIgD）重链基因的cDNA序列全长，该基因全长3357bp，包含1个2997bp的开放阅读框，编码999个氨基酸，基因结构为VDJ-μ1—δ1—δ2—δ3—δ4-δ5—δ6—δ7-TM。重链恒定区31～67氨基酸序列同源比对结果显示，其与庸鲽（78％）、鳜（71％）、牙鲆（68％）具有较高的同源性；多序列比对结果显示，大菱鲆mIgD的每个8恒定区内均存在色氨酸与半胱氨酸保守位点。利用邻位相连法构建硬骨鱼类免疫球蛋白系统发育树，结果显示，鱼类IgD聚为一大支，大菱鲆IgD与庸鲽及牙鲆聚为一支。利用RT-PCR分析了大菱鲆IgD重链基因的组织差异表达，结果显示，其在外周血白细胞、脾脏、前肾及中。肾组织中具有较高的表达。将大菱鲆腹腔注射福尔马林灭活鳗弧菌后，实时荧光定量PCR检测其前肾组织中mIgD重链基因应答表达量，结果显示，mIgD重链基因在注射鳗弧菌后呈显著下调趋势，在注射后8h时降至最低值，其相对表达量约为对照组的1／28，然后呈逐渐恢复上调趋势，在48h时mIgD相对表达量与对照组无显著差异。
- 陈孔茂唐小千绳秀珍邢婧战文斌
- 关键词：大菱鲆免疫球蛋白D基因克隆
- 大菱鲆血清免疫球蛋白IgM单克隆抗体的制备及其特性分析被引量：3
- 2016年
- 本研究运用硫酸铵盐析法结合Protein A亲和层法从大菱鲆血清中分离、纯化免疫球蛋白IgM。SDS-PAGE分析结果显示,纯化的血清IgM主要有2条蛋白带,分子量分别为78和27kDa,分别为大菱鲆IgM的重链与轻链。以纯化的IgM免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合,将融合后的细胞置于含HAT的培养基中培养。利用ELISA和Western blotting筛选杂交瘤,并利用有限稀释法对阳性杂交瘤进行单克隆,最终共获得3株抗大菱鲆血清IgM单克隆抗体,分别命名为1B2、1G4和2A1,抗体分型结果显示3株单抗均属IgG。Western blotting结果显示,单抗1B2和1G4可特异性识别大菱鲆IgM重链蛋白,而单抗2A1则特异性识别轻链蛋白。同时,以制备的腹水单抗1G4结合免疫荧光检测显示,单抗1G4可识别大菱鲆外周血、脾及前肾组织中表面IgM阳性(sIgM^+)细胞;流式细胞术分析显示,大菱鲆外周血、脾和前肾白细胞中sIgM^+细胞比例分别为48.07%,20.05%和18.45%。研究结果显示,制备的抗大菱鲆血清IgM单抗特异性高、反应性强,可为研究大菱鲆免疫系统及免疫应答动态提供有力的工具。
- 张伟唐小千绳秀珍邢婧战文斌
- 关键词：大菱鲆血清IGM单克隆抗体免疫荧光
- 大菱鲆多聚免疫球蛋白受体基因的克隆及表达分析被引量：12
- 2013年
- 鱼类多聚免疫球蛋白受体(polymeric immunoglobulin receptor,pIgR)是黏膜免疫系统的关键因子,能够介导多聚免疫球蛋白向黏液中的转运和分泌。本研究利用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification ofcDNA ends,RACE),首次得到了大菱鲆(Scophthalmus maximus)pIgR完整的cDNA序列,全长1 584 bp,该序列包含一个1 005 bp的开放阅读框及5’和3’UTR,编码334个氨基酸。同源性比较发现,大菱鲆pIgR氨基酸序列与牙鲆(Paralichthys olivaceus)、斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)鲀、红鳍东方(Takifugu rubripes)的序列相似性分别是74%、74%和59%,表现出较高的保守性。多序列比对显示,硬骨鱼pIgR包含两个ILD(Ig-like domain),分别对应哺乳类的ILD1和ILD5区域。系统进化树分析表明,大菱鲆pIgR和牙鲆的聚为一支。半定量RT-PCR显示,pIgR在健康大菱鲆各组织中均有表达,但表达水平不同,其中在黏膜相关淋巴组织中表达最强。经灭活的鳗弧菌菌液浸泡处理后,实时荧光定量PCR结果显示,大菱鲆各组织中pIgR的相对表达量在72 h内均呈现先增加后减少的趋势,在48 h内均有一个最高值出现,且黏膜相关淋巴组织中峰值出现较早,说明pIgR在硬骨鱼类黏膜免疫中发挥了重要作用。
- 丁冰洁绳秀珍唐小千邢婧战文斌
- 关键词：大菱鲆黏膜免疫克隆基因表达
- 牙鲆注射免疫鳗弧菌灭活疫苗后13种免疫相关基因表达的变化被引量：4
- 2016年
- 为制备鳗弧菌（Vibrio anguillarum）全菌灭活疫苗,采用腹腔注射的方式免疫牙鲆（Paralichthys olivaceus）。于免疫后0、4、8、12、24、48、72、96h和7、14d取脾、头肾、鳃组织,提取mRNA,应用实时荧光定量PCR法检测3个组织中Toll-like受体（TLR）2、TLR5M、髓样分化因子MyD88、核转录因子（NF）-κB、白介素（IL）-6、干扰素（IFN）γ、趋化因子CXC、补体C3、C型溶菌酶（C-Lyz）、热休克蛋白（Hsp）-70、主要组织相容性复合体MHC II、T细胞表面受体CD4和膜结合型免疫球蛋白（mIg）D这13种免疫相关基因的表达。研究显示：注射免疫后,3个组织中,除了mIgD和TLR5M基因,其余11种基因与对照组相比均呈上调表达,上调表达高峰均在12~72h,基因表达量最高值是对照组的2~30倍;mIgD基因的表达显著下调或无显著差异,基因表达量最低值出现在8~12h,最低值是对照组的0.02~0.2倍;TLR5M基因的表达无显著变化。在头肾和脾脏组织中,除了TLR5M、CXC、C-Lyz和mIgD 4个基因其余9个基因的表达量显著高于鳃组织,且表达量最大值的出现时间均早于鳃组织。研究结果表明：腹腔注射免疫鳗弧菌全菌灭活疫苗能引起牙鲆脾脏、头肾和鳃免疫相关基因的快速变化。脾脏、头肾中基因的表达量大多显著高于鳃组织,且表达高峰值的出现早于鳃组织。注射免疫后,脾脏或头肾组织中TLR2、NF-κB和IL-6基因的表达量上调较快、较高,可作为注射免疫鳗弧菌全菌灭活疫苗效果的主要评价指标。本研究为牙鲆疫苗免疫效果的评价提供了理论依据。
- 薛洁宋晓青邢婧战文斌
- 关键词：牙鲆鳗弧菌灭活疫苗注射免疫免疫相关基因
