国家自然科学基金(30672431)
- 作品数：28 被引量：66H指数：5
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- 肝癌及癌旁肝组织的高尔基体差异蛋白质分析被引量：1
- 2010年
- 目的 筛选并鉴定肝癌及癌旁肝组织高尔基体蛋白质组中差异表达的蛋白质，从高尔基体层面解释肝癌的发生和发展机制，为早期诊断和抗癌药物的研发提供线索。方法应用亚细胞比较蛋白质组学研究方法，比较分析肝癌及癌旁肝组织高尔基体蛋白质组。收集肝癌患者手术切除的癌组织和癌旁肝组织标本，蔗糖密度梯度离心法分离高尔基体。建立并优化两种组织高尔基体的双向电泳方法，用PDQuest软件分析差异表达的蛋白质点，然后用质谱仪获取相应蛋白点的肽质指纹图谱，联网到SwissProt蛋白质组数据库鉴定获得的差异蛋白质点，最后用Westernblot验证双向电泳结果。蛋白质相对表达量的比较采用配对t检验。结果获得了分辨率和重复性均较好的双向电泳银染图谱。与癌旁肝组织相比，肝癌高尔基体蛋白质组有包括膜联蛋白5在内的27个蛋白质位点表达上调，包括染色体修饰蛋白2b在内的20个蛋白质位点表达下调，初步鉴定出了其中17个蛋白质，并用Westernblot从蛋白质水平上验证了双向凝胶电泳结果。结论肝癌及癌旁肝组织高尔基体蛋白质组具有不同的蛋白质位点，这些差异表达的蛋白质涉及到细胞的能量代谢、肿瘤的侵袭和转移，细胞周期调控等方面，为进一步阐释高尔基体在肿瘤的发生和发展中所起的作用提供了有价值的信息。
- 肖钟易永芬何婷婷李艳青
- 关键词：高尔基器蛋白质组光谱法
- 高尔基体基质蛋白130、14-3-3ζ、整合素α3在中、低分化胃癌组织的表达及意义被引量：3
- 2014年
- 目的:检测高尔基体基质蛋白130(Golgi matrix protein 130,GM130)、14-3-3 zeta(14-3-3ζ)、整合素α3(integrin alpha3,Integrinα3)在正常胃组织和中、低分化胃癌组织中的表达,并由此探讨其与胃癌的关系。方法:运用免疫组织化学检测(strept avidin-biotin complex,SABC)法分别检测临床收集的84例胃癌患者的胃癌组织和正常胃组织(距癌肿边缘5 cm以上的胃组织)GM130、14-3-3ζ、Integrinα3的表达情况,并结合临床病理资料进行分析;用RT-PCR和Western blot分别检测42例胃癌(低分化胃癌24例,中分化胃癌18例)和42例正常胃组织GM130、14-3-3ζ、Integrinα3的m RNA和蛋白表达情况。结果:(1)GM1301、14-3-3ζ2、Integrinα33在胃癌组织中的表达阳性率分别为88.1%、90.5%、95.2%,明显高于上述各指标在正常胃组织上的阳性表达率(52.4%、27.4%、42.9%);低分化胃癌组上述3个指标的表达较中分化胃癌组高,且2组间差异有统计学意义(P1=0.000、P2=0.007、P3=0.000)。Spearman等级相关性分析显示,胃癌中GM130、14-3-3ζ、Integrinα3之间表达呈两两正相关(P<0.05)。(2)GM130、14-3-3ζ、Integrinα3的表达均与年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤直径、肿瘤浸润深度、有无淋巴结转移无关(P>0.05);而与肿瘤病理组织学分级及临床分期有关(P<0.05)。(3)RT-PCR及Western blot结果显示GM130、14-3-3ζ、Integrinα3 m RNA和蛋白质的表达在胃癌组较正常胃组织组高,低分化胃癌组较中和分化胃癌组高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:GM130的异常表达可能在胃癌的发生发展中发挥重要作用。
- 陈婕牟玲易永芬
- 关键词：胃癌整合素Α3
- 高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ、E-cadherin和α-catenin在卵巢上皮肿瘤组织和不同转移能力的卵巢癌细胞中的表达被引量：5
- 2012年
- 目的:检测高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgiα-mannosidaseⅡ,GMⅡ)、E-cadherin和α-catenin在不同卵巢上皮肿瘤组织和不同转移能力的卵巢癌细胞中的表达。方法:运用免疫组织化学法检测46例卵巢上皮恶性肿瘤(其中有大网膜或淋巴结转移者27例)、15例卵巢上皮交界性肿瘤及12例卵巢上皮良性肿瘤组织中GMⅡ、E-cadherin和α-catenin的表达情况。体外培养卵巢癌A2780、SKOV-3和HO-8910细胞,分别应用RT-PCR、免疫荧光和蛋白质印迹法检测GMⅡ、E-cadherin和α-catenin mRNA和蛋白的表达情况。结果:在卵巢上皮恶性肿瘤中GMⅡ的阳性表达率(87%)和E-cadherin、α-catenin的异常表达率(80%和72%)明显高于卵巢上皮交界性肿瘤(60%、20%和40%)和卵巢上皮良性肿瘤(42%、0%和17%),且有转移患者肿瘤组织中的阳性表达率和异常表达率明显高于无转移者(P<0.05)。A2780、SKOV-3和HO-8910细胞中GMⅡ荧光表达强度逐渐增强,E-cadherin和α-catenin荧光表达强度逐渐减弱。在A2780、SKOV-3、HO-8910中,GMⅡmRNA和蛋白表达水平逐渐增加,而E-cadherin和α-catenin mRNA及蛋白表达水平则逐渐减弱,各组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论:GMⅡ、E-cadherin和α-catenin可能在卵巢癌的恶性进展中发挥重要作用,GMⅡ有望成为卵巢癌预后的标志和治疗靶点。
- 卢玉娟罗祎杨雅莹易永芬
- 高尔基体囊泡转运蛋白P115基因沉默对胃癌细胞凋亡的影响及其机制被引量：1
- 2012年
- 目的探讨高尔基体囊泡转运蛋白P115基因沉默对胃癌BGC-823细胞凋亡的影响及其可能的相关机制。方法将含p115基因的重组质粒p115 shRNA-1318转染BGC-823细胞,并设shNC(阴性对照)转染组和空白对照组,免疫荧光显微镜检测转染效果;RT-PCR法检测细胞中p115和巨噬细胞游走抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)基因mRNA的转录水平;Western blot检测细胞中P115、MIF及核内肿瘤抑制蛋白质P53的表达水平;MTT法检测细胞的增殖活力;流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期的分布。结果转染后48 h,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,表明转染成功;与对照组相比,p115 shRNA-1318组细胞中的p115和MIF基因mRNA的转录水平及蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05),细胞核内P53蛋白的表达水平明显增加(P<0.05),细胞的增殖活力明显下降(P<0.05),细胞凋亡数量明显增加(P<0.05),G1/G2期细胞数量明显增多,S期细胞数量明显减少(P<0.05)。结论沉默p115基因可促进胃癌细胞的凋亡,其调控机制可能是通过调控MIF因子来完成的。
- 屈玉玲易永芬邓玮文雪闫田静
- 关键词：巨噬细胞游走抑制因子肿瘤抑制蛋白质P53胃癌细胞凋亡
- p115和MIF在肝癌细胞和正常肝细胞的表达情况
- 2011年
- 目的:研究人肝癌低分化SMCC-7721细胞株,高分化HepG2细胞株和人正常肝细胞株LO2的高尔基体转运蛋白p115和巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitoryfactor,MIF)的表达情况。方法:采用RT-PCR方法检测3组细胞株中p115和MIF的mRNA表达水平。用Western blot方法和细胞免疫组化方法检测3组细胞株中p115和MIF的蛋白表达情况。结果:SMCC-7721,HepG2的p115和MIF mRNA表达和蛋白表达水平明显增加且SMCC-7721表达更强,与对照组正常肝细胞株LO2的表达量比较有显著差异(P<0.05);细胞免疫组化方法结果显示:SMCC-7721,HepG2中p115在主要位于除高尔基体外的细胞质中,但在细胞质中HepG2着色相对较淡,而LO2中位于细胞核旁的高尔基体上。MIF主要分布于细胞质中,其在SMCC-7721、HepG2、LO23组细胞表达量呈明显减弱,统计学有显著差异(P<0.05)。结论:p115和MIF的含量在SMCC-7721、HepG2、LO2 3组细胞株中呈递减性变化。说明随着细胞恶性程度增加,p115和MIF表达增高,提示二者可能与肿瘤细胞的异常分化有关。
- 文雪易永芬邓玮闫田静屈玉玲
- 关键词：巨噬细胞移动抑制因子HEPG2
- shRNA沉默P115基因对胃癌细胞增殖相关蛋白表达的影响及机制
- 2013年
- 目的探讨高尔基体囊泡转运蛋白(colgi-vesicular transport protein,P115)基因沉默对胃癌细胞株BGC-823中增殖相关因子细胞周期素D1(cyclinD1)、微小染色体维持缺陷蛋白2(mini chromosome maintenance protein 2,Mcm2)和增殖细胞核抗原(proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)表达的影响及其可能的机制。方法采用脂质体介导法将重组表达质粒P115-shRNA2(P115-shRNA2组)和阴性对照质粒shNC(阴性对照组)转染至高表达P115的胃癌细胞株BGC-823中,并设未转染组,经G418筛选出稳定转染细胞,实时定量PCR(Real-time PCR)法检测细胞中P115、巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)、cyclinD1、Mcm2和PCNA基因mRNA的转录水平;Western blot法检测细胞中P115、MIF、pERK1/2、cyclinD1、Mcm2和PCNA蛋白表达水平;免疫共沉淀法检测BGC-823细胞中P115与MIF间的相互作用;ELISA法检测细胞上清液中MIF的分泌水平。结果与未转染组和阴性对照组相比,P115-shRNA2组细胞中P115、MIF、cyclinD1、Mcm2和PCNA的mRNA和蛋白表达水平均明显降低,ERK1/2的磷酸化水平明显下调,BGC-823细胞培养上清中MIF的含量明显降低;P115蛋白可在抗MIF的免疫沉淀物中检出,P115和MIF在BGC-823细胞中存在特异性的相互作用。结论 P115基因沉默下调胃癌细胞中cyclinD1、Mcm2和PCNA的表达,其分子机制可能与P115通过调控MIF的表达和分泌,进而启动下游的ERK1/2信号通路有关。P115可作为研究胃癌细胞增殖分子机制的新靶点。
- 邓玮易永芬屈玉玲闫田静文雪
- 关键词：短发夹RNA胃癌细胞周期素D1细胞增殖
- 高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ和E-钙黏素在正常肝组织及肝癌组织中的表达及其意义被引量：2
- 2011年
- 目的探讨高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(GMⅡ)和E-钙黏素(E-cadherin)在正常肝组织及不同分化的肝癌组织中的表达及其意义。方法采用RT-PCR法检测GMⅡ和E-cadherin mRNA在正常肝组织、高分化及中低分化肝癌组织中的表达;免疫组化SP法及Western blot法检测GMⅡ和E-cadherin蛋白在3种肝组织中的表达,并对GMⅡ和E-cadherin的差异表达进行相关性分析。结果 RT-PCR及Western blot分析显示,GMⅡmRNA和蛋白在正常肝组织中表达水平最低,在中低分化肝癌组织中表达水平最高,在高分化肝癌组织中表达居中,E-cadherin的表达则相反,各组间表达差异均有统计学意义(P<0.05);免疫组化SP法检测显示,GMⅡ主要表达于正常肝组织及肝癌组织的胞浆,在正常肝组织、高分化及中低分化肝癌组织的表达阳性率分别为40%、64%和86%,E-cadherin在正常肝组织的胞膜、胞浆中均有表达,而在肝癌组织中则主要表达于胞浆,其表达阳性率分别为70%、33%和9%,各组间表达差异均有统计学意义(P<0.05);GMⅡ和E-cadherin表达的Pearson相关系数r值为-0.415,P值为0.01。结论 GMⅡ和E-cadherin在肝癌组织中的表达呈负相关,GMⅡ对肝癌的发生发展可能发挥一定的作用。
- 闫田静易永芬邓玮文雪屈玉玲
- 关键词：E-钙黏素肝肿瘤
- α-甘露糖苷酶Ⅱ基因沉默对人胃癌BGC-823细胞增殖及凋亡的影响被引量：2
- 2012年
- 目的探讨沉默高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgiα-mannosidaseⅡ,GMⅡ)基因的表达对人胃癌BGC-823细胞增殖与凋亡的影响。方法根据GenBank中登录的人GMⅡ基因mRNA序列及siRNA设计原则,设计了4条siRNA,并构建4个针对靶点的重组表达质粒pGPU6/GFP/Neo-1140、pGPU6/GFP/Neo-1303、pGPU6/GFP/Neo-1406和pGPU6/GFP/Neo-1817,同时合成阴性对照质粒pGPU6/GFP/Neo-shNC,经Lipofectamine 2000分别转染BGC-823细胞,通过RT-PCR及Western blot检测转染细胞中GMⅡ基因mRNA和蛋白的表达,筛选沉默效果最佳的质粒;经MTT试验、细胞周期分布分析、Hoechst33258和Annexin V-FITC/PI双染试验分别检测沉默GMⅡ基因对人BGC-823细胞增殖与凋亡的影响。结果 pGPU6/GFP/Neo-1303组GMⅡ基因mRNA和蛋白的表达明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05),表明pGPU6/GFP/Neo-1303组沉默效果最好;与空白对照组和阴性对照组相比,pGPU6/GFP/Neo-1303组BGC-823细胞增殖抑制率明显升高(P<0.01),G1期细胞比例明显上升(P<0.05),S期细胞比例明显下降(P<0.01),细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。结论已成功沉默BGC-823细胞中GMⅡ基因的表达,从而抑制BGC-823细胞的增殖并促进其凋亡,GMⅡ可能成为防治胃癌的新靶点。
- 杨雅莹易永芬
- 关键词：RNA干扰高尔基体胃癌基因沉默细胞增殖
- RNA干扰P115基因对胃癌细胞巨噬细胞移动抑制因子表达的抑制作用被引量：15
- 2011年
- 目的构建高尔基体转运蛋白P115基因shRNA表达载体,探讨P115基因沉默对胃癌细胞株BGC-823中巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor,MIF)表达的影响。方法设计4对针对P115基因的shRNA序列,构建重组表达质粒,转染高表达P115的胃癌细胞株BGC-823。RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学检测P115及MIF的mRNA和蛋白的表达。结果 4个P115基因shRNA质粒经单酶切和测序证实构建正确;转染BGC-823细胞后,均能抑制P115基因的表达,其中以pGPU6/GFP/Neo-shP115-2的沉默效果最好,其对P115基因mRNA表达的抑制率为75.07%,对P115蛋白表达的抑制率为70.97%;转染pGPU6/GFP/Neo-shP115-2后,MIF基因的mRNA及蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。结论 P115基因沉默后,BGC-823细胞MIF的表达明显降低,提示P115可能参与调节胃癌细胞MIF的表达,P115基因可作为研究胃癌发生发展分子机理的新靶点。
- 邓玮易永芬文雪闫田静屈玉玲
- 关键词：胃肿瘤巨噬细胞移动抑制因子RNA干扰
- 沉默高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ表达对人胃癌BGC-823细胞侵袭和迁移能力的影响被引量：2
- 2012年
- 目的:探讨RNA干扰沉默高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(Golgiα-mannosidaseⅡ,GMⅡ)基因表达对人胃癌BGC-823细胞侵袭和迁移的影响。方法:为沉默GMⅡ基因,构建了4个分别针对不同靶位点的短发夹RNA(shorthairpinRNA,shRNA)质粒表达载体,同时合成阴性对照质粒表达载体。应用LipofectAMINE2000将质粒转染入BGC-823细胞。分别采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测转染后GMⅡmRNA和蛋白表达的变化,选出沉默效果最佳的质粒。应用Transwell侵袭实验和划痕损伤实验分别检测GMⅡ基因沉默对人胃癌细胞BGC-823侵袭和迁移能力的影响。结果:质粒载体pGPU6/GFP/Neo-1303沉默GMⅡ基因的效果最好。转染pGPU6/GFP/Neo-1303组穿透小室基质的细胞数明显少于空白对照组和转染阴性对照组(P<0.05)。无血清培养液培养24h后,转染pGPU6/GFP/Neo-1303组细胞的迁移能力较空白对照组和转染阴性对照组明显降低(P<0.05)。结论:RNA干扰技术可沉默人胃癌BGC-823细胞中GMⅡmRNA和蛋白的表达,从而抑制BGC-823细胞的侵袭和迁移能力。GMⅡ可能成为胃癌治疗的新靶点之一。
- 杨雅莹易永芬
- 关键词：胃肿瘤基因沉默肿瘤侵润
