国家自然科学基金(30800650)
- 作品数：8 被引量：9H指数：2
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- PDX-1表达质粒的构建及表达
- 2009年
- 目的:为进一步研究PDX-1基因的功能打下基础。方法:从人的胰腺cDNA中PCR扩增PDX-1基因的阅读框架,构建质粒pAAV-PDX-1。用pAAV-PDX-1转染293T细胞48小时后,用RT-PCR和Western Blot方法检测293T细胞中mRNA和蛋白水平PDX-1的表达。结果:转染了pAAV-PDX-1的293T细胞中有PDX-1的表达,而在转染质粒pAAV-MCS和未转染的293T细胞中均没有检测到PDX-1的表达。结论:构建的pAAV-PDX-1质粒在mRNA和蛋白水平都能表达PDX-1。
- 夏华强刘律君徐小明卢光琇
- 关键词：质粒构建293T细胞
- 组蛋白去乙酰化酶抑制剂对人胚胎成纤维细胞表观遗传的影响
- 2011年
- 【目的】探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂（曲古菌素A（TSA）和丙戊酸盐（VPA））对人胚胎成纤维细胞（human embryonic fibroblasts,hEF）组蛋白乙酰化（acH4K12）和组蛋白单甲基化（H4K20me1）的影响,为进一步探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂对人类体细胞核移植胚胎表观遗传重编程的作用机制奠定基础。【方法】使用0400 nmol/L TSA或04 mmol/L VPA处理hEF 24 h,用核型分析及荧光原位杂交（FISH）检测hEF细胞遗传学变化,使用间接免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜观察TSA和VPA对hEF的acH4K12及H4K20me1水平的影响。【结果】TSA处理组hEF细胞呈现出形态学变化,且TSA具有细胞毒性作用。VPA处理组与未处理组细胞无明显的形态学变化和细胞毒性作用。核型分析及FISH检测结果显示,TSA和VPA处理组与未处理组均维持正常的核型（46,XX）,未发生明显的细胞遗传学改变。间接免疫荧光染色结果表明,acH4K12和H4K20me1水平随着TSA和VPA浓度的增加而升高。【结论】TSA和VPA可以提高hEF的acH4K12和H4K20me1水平,且未发生明显的细胞遗传学变化。
- 徐小明段馨周欢群林戈卢光琇
- 关键词：组蛋白去乙酰化酶抑制剂表观遗传成纤维细胞
- PDX-1基因对人胚肾细胞胰岛发育相关基因表达的影响
- 2010年
- 【目的】研究人PDX-1基因对胰岛发育相关基因和胰岛素基因(Insulin,INS)表达的影响,探讨PDX-1基因诱导非β细胞为胰岛素分泌细胞的可能性。【方法】采用PCR扩增技术,从人的胰腺cDNA中扩增PDX-1基因和INS基因的阅读框架,分别构建了质粒pAAV-PDX-1和pAAV-INS;将pAAV-PDX-1转染人胚肾细胞(293T)48 h后,RT-PCR检测293T细胞中胰岛发育相关基因的表达;再将pAAV-PDX-1和pAAV-INS共转染293T细胞48 h后,RT-PCR检测293T细胞中INS的表达。【结果】转染pAAV-PDX-1的293T细胞中,检测到胰岛发育相关基因PDX-1、Ngn3、PC2、BETA2的表达;PDX-1没有直接增强INS基因表达的作用。【结论】在293T细胞中,PDX-1基因对胰岛发育相关基因的表达有重要影响,PDX-1在诱导非β细胞为胰岛素分泌细胞的过程中可能有着重要的作用。
- 夏华强徐小明刘律君卢光琇
- 关键词：293T细胞
- 一种高效、快捷、经济的小鼠胰岛细胞分离纯化方法被引量：3
- 2011年
- 采用改良的胶原酶P胆总管内逆行灌注膨胀胰腺的分离方法,比较Ficoll-400不连续密度梯度离心法和人工挑取法两种纯化胰岛的方法,用双硫腙(DTZ)对胰岛细胞团进行特异性染色计算胰岛产量及纯度,用台盼蓝染色判定胰岛细胞活性,使用间接免疫荧光法检测体外培养7 d后胰岛的功能.采用人工挑取法平均每只小鼠可获取的胰岛细胞团(245±35.6个)明显高于密度梯度离心法(120±26.3个)(n=5,P<0.05),两种方法分离纯化的胰岛活力均大于98%;但人工挑取法获得胰岛细胞团的纯度(100%)要高于密度梯度离心法(90%);纯化胰岛所用时间,采用人工挑取法(22±4 min)也少于密度梯度离心法(31±3 min).间接免疫荧光染色检测体外培养7 d后的胰岛细胞团,两种方法分离纯化的胰岛细胞团均具有良好的功能.胶原酶P胆总管内灌注消化分离法联合人工挑取纯化胰岛细胞团的方法,是一种高效、快捷、经济的小鼠胰岛细胞团分离纯化方法.
- 徐小明林戈段馨卢光琇
- 关键词：胰岛分离纯化小鼠
- miR375表达质粒构建及表达研究被引量：1
- 2010年
- 目的寻找一种高效、简便的构建表达miRNA质粒的方法。方法该研究用PCR方法直接从小鼠gDNA扩增了包含miRNA375(miR375)前体序列在内的一个126bp片段以构建质粒pAAV-miR375。该研究用pAAV-miR375转染Hela细胞48h后,用定量RT-PCR方法和Northernblot检测Hela细胞中miR375的表达。结果转染了pAAV-miR375的Hela细胞中有miR375的表达,而在转染了空质粒pAAV-MCS和未转染的Hela细胞中没有检测到miR375的表达。结论该研究所构建的pAAV-miR375质粒能够表达miR-NA375。作者介绍的这一种构建表达miRNA质粒的方法比以往的方法更快速、高效、简便和保证序列的正确性。
- 夏华强潘艺徐小明刘律君彭炬卢光琇
- 关键词：质粒构建HELA细胞
- 人类卵母细胞及体外受精发育阻滞胚胎中的组蛋白乙酰化水平的检测
- 2011年
- 目的探讨人类不同成熟阶段的卵母细胞及体外受精发育阻滞胚胎中的组蛋白乙酰化水平的变化规律。方法收集接受卵胞浆内单精子注射技术(IC SI)治疗的患者废弃的卵母细胞生发泡(G V)期、第一次减数分裂中期(MⅠ期)和经体外成熟培养发育至第二次减数分裂中期(MⅡ期)的卵母细胞,采用间接免疫荧光染色方法对人类不同成熟阶段的卵母细胞及体外受精阻滞胚胎中的组蛋白的(H 4K12和H 3K9)乙酰化水平进行检测。结果人类G V期卵母细胞中组蛋白H 4K12和H 3K9均强表达。74.1%的MⅠ期卵母细胞中H 4K12和H 3K9的乙酰化水平显著降低。79.2%的MⅡ期卵母细胞中组蛋白H 4K12乙酰化呈微弱表达或不表达,而来源于高龄妇女的MⅡ期卵母细胞仍维持较高的H 4K12乙酰化水平。在MⅡ期卵母细胞中几乎检测不到H 3K9的乙酰化表达。83.3%的发育阻滞胚胎中组蛋白H 4K12和H 3K9的乙酰化水平较高。结论人类卵母细胞的成熟经历了一个组蛋白乙酰化到去乙酰化的动态修饰过程,体外受精后又重新建立新的组蛋白乙酰化修饰。
- 徐小明周欢群林戈卢光琇
- 关键词：卵母细胞体外成熟组蛋白乙酰化
- 显微受精废弃的人类卵母细胞体外成熟及孤雌激活被引量：5
- 2011年
- 以卵胞浆单精注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)后废弃的未成熟人类卵母细胞(生发泡期卵母细胞(the germinal vesicle,GV)和第一次减数分裂中期卵母细胞(the metaphase,MI))为材料,使用卵母细胞体外成熟培养液培养未成熟的卵母细胞,分别在人类绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,hCG)注射后45、60、84 h观察卵母细胞成熟情况.分别使用钙离子载体(calcium ionophore,CI)A23187联合6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)法或精子提取物卵胞质内注射(sperm extracts intracytoplasmic injection,SEII)法两种不同的激活方法对体外成熟MII的卵母细胞进行孤雌激活,评价其体外发育潜能.MI卵子体外成熟率要显著高于GV(75.2%vs 30.6%)(P<0.01).与CI/6-DMAP法相比使用SEII/6-DMAP法在激活率(87.5%vs 70.2%)上要明显高于CI/6-DMAP法(P<0.05),但在卵裂率(65.7%vs 72.5%)和桑囊率(0%vs 5.0%)上SEII/6-DMAP法要低于CI/6-DMAP法.注射hCG 45 h组的卵母细胞激活率(91.3%vs 57.9%)、卵裂率(85.7%vs 57.9%)及桑囊率(9.5%vs 0%)均显著高于注射hCG 60 h组(P<0.01).56.8%(117/206)的ICSI废弃的未成熟卵母细胞可以在体外发育成熟,激活后具有一定的发育潜能,卵龄对卵母细胞的质量和发育能力影响较大.
- 徐小明陆长富周虹林戈卢光琇
- 关键词：卵母细胞体外成熟孤雌激活
- 人类胚胎干细胞与小鼠囊胚嵌合的探讨
- 2011年
- 【目的】探讨人类胚胎干细胞（Human embryonic stemcells,hESCs）能否在小鼠胚胎环境中生存并参与其各个组织器官的分化,为hESCs与小鼠囊胚嵌合的可行性研究提供依据。【方法】将154枚受精后3.5 d（3.5days postcoitum,3.5 dpc）ICR品系小鼠囊胚随机分为3组：试验组（注射hESCs）、模拟注射组（注射针仅刺破透明带及滋养层细胞,但不注射细胞和溶液）及对照组（未注射）,于注射后培养24 h统计囊胚完全孵化率。将稳定转染增强绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）的含有9~15个hESCs的小细胞团块,显微注射入3.5 dpcICR品系小鼠囊胚腔内,注射后分别于3,24,48,69,77,94和116 h,在普通荧光显微镜下观察EGFP阳性细胞的定位与动态分布情况,并将嵌合体胚胎移植入假孕母鼠子宫内,分别于移植后第4天和第6天处死孕鼠,普通荧光显微镜下观察EGFP阳性细胞在整个小鼠胚胎中的分布情况。【结果】注射后24 h,试验组和模拟注射组的囊胚完全孵化率分别为73.6%和77.1%,均极显著高于对照组（38.3%）（P〈0.01）,有88.9%（32/36）的胚胎中的hESCs迁移并定位在小鼠内细胞团（ICM）及其临近的滋养层细胞上;体外培养48 h后,EGFP阳性细胞数进一步减少;116 h后,只有1枚胚胎仍残留3~4个EGFP阳性细胞,且散在分布于ICM克隆之外。体内发育试验结果显示,将43枚注射后的嵌合体囊胚移植入6只代孕母鼠子宫内,获得了22枚脱膜,有17枚脱膜中含有胚胎,其中形态正常胎儿14枚,没有胚胎含有EGFP阳性细胞。【结论】hESCs很难与小鼠囊胚正常嵌合。
- 徐小明杜丽丽林戈段馨卢光琇
- 关键词：人类胚胎干细胞囊胚小鼠嵌合体
