天津市科技攻关项目(033182711)
- 作品数：10 被引量：151H指数：6
- 相关作者：徐琪寿郭长江张绪梅刘云李剑欣更多>>
- 相关机构：军事医学科学院中国医学科学院放射医学研究所天津医科大学更多>>
- 发文基金：天津市科技攻关项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学理学轻工技术与工程化学工程更多>>
- 大肠杆菌trpBA和serA基因的串联表达被引量：4
- 2009年
- 大肠杆菌trpBA基因编码的色氨酸合成酶（tryptophan synthetase，TSase）是色氨酸合成的关键酶；serA基因编码的磷酸甘油酸脱氢酶（D-3-phosphoglycerate-dehydrogenase，PGDH）为L-丝氨酸合成（色氨酸合成的底物）的关键酶。为了通过基因工程手段来增加色氨酸的产量，在利用高效的原核表达载体pET22b（＋）分别对trpBA和serA基因克隆表达的基础上，采用PCR方法扩增了抗反馈抑制的serA和trpBA基因，将两基因串联于pET22b（＋）载体上，共构建了4种方式的串联质粒，实现了2种蛋白酶在大肠杆菌中的共表达。聚丙烯酰胺电泳分析显示，ABA—I重组菌株在37kD（PGDH）、29kD（色氨酸合成酶的α,亚基）、44kD（β亚基）处均有明显的蛋白表达带。4种串联表达质粒重组菌的TSase酶活性，分别比含空载体菌相应酶的活性提高2～4倍，PGDH酶活性分别提高约2．1～3．6倍。经摇瓶发酵实验表明酶活性较高的ABA—I菌株色氨酸合成量亦最高，约为对照菌株的20．2倍。
- 张绪梅郭长江刘云徐琪寿
- 关键词：色氨酸大肠杆菌
- 大肠杆菌trpBA基因的克隆表达被引量：6
- 2006年
- 目的:提高大肠杆菌中色氨酸合成酶的表达量和表达活性。方法:利用PCR方法从大肠杆菌K-12的基因组中直接克隆出紧密连锁trpB和trpA基因(简称trpBA),并将其连接到原核表达载体pet22b(+)中,得到重组质粒pet22b(+)-trp-BA,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析并用比色法测定其活性。结果:凝胶电泳可见PCR扩增产物大小约为2kb,SDS-PAGE鉴定目的蛋白的Mr分别约为29000和44000,色氨酸合成酶α、β亚基分别得到了高效表达,色氨酸合成酶活性提高到对照菌的3.7倍。结论:成功构建了重组质粒pet22b(+)-trpBA,色氨酸合成酶的表达量和表达活性在大肠杆菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定基础。
- 张绪梅郭长江刘云杨继军韦京豫徐琪寿
- 关键词：大肠杆菌克隆酶活性
- 离子交换法与氨基酸的分离纯化被引量：25
- 2005年
- 离子交换法广泛用于氨基酸的分离纯化。文章综述了离子交换法与氨基酸的分离纯化,包括分离纯化单一氨基酸及对氨基酸混合物进行分组分离纯化。
- 武彩莲郭长江
- 关键词：离子交换氨基酸分离纯化
- 大肠杆菌邻氨基苯甲酸合成酶编码基因trpED的克隆与表达被引量：3
- 2007年
- 目的:通过基因重组的方法获得在体外具有邻氨基苯甲酸合成酶活性的基因trpED,为进一步解除反馈抑制的基因改造寻找靶标。方法:分别构建重组质粒pBV220-trpE和pBV220-trpD;由于trpE和trpD存在翻译偶联现象,将其自大肠杆菌基因组中经PCR扩增得到,构建新的表达质粒pBV220-trpED。结果:SDS-PAGE显示,包含质粒pBV220-trpED的重组菌在相对分子质量约53000(trpE基因表达)和56000(trpD基因表达)处的蛋白表达量明显增多,且邻氨基苯甲酸合成酶活性是对照的3倍。结论:翻译偶联的存在直接影响蛋白活性的发挥;重组质粒pBV220-trpED的获得为进一步的基因改造,以提高色氨酸产量奠定了研究基础。
- 李剑欣郭长江刘云林维平张绪梅徐琪寿
- 关键词：色氨酸生物合成
- 基因工程在L-色氨酸生产中的应用研究进展被引量：8
- 2005年
- 尽管L-色氨酸的生产已取得诸多进展,但由于其合成代谢途径长、调控复杂,故一直未能达到工业化生产的要求。本文主要概述近年来通过构建色氨酸合成酶和色氨酸酶基因工程菌株与酶法相结合来生产L-色氨酸方面的进展及其局限性,并从增加前体物质代谢流、限速酶量和消除途径抑制因素等方面着重论述第三代基因工程———代谢工程在L-色氨酸生产方面的研究状况,指出代谢工程育种为今后色氨酸育种的主要方向。
- 张绪梅郭长江李剑欣徐琪寿
- 关键词：L-色氨酸基因工程代谢工程
- 大肠杆菌莽草酸途径限速酶多基因盒的构建及基因替换被引量：2
- 2004年
- 优化大肠杆菌芳香族氨基酸生物合成代谢途径 ,构建莽草酸代谢途径限速酶的多基因盒PtacaroAaroCaroBkan .利用Red重组系统 ,在破坏整体调控基因csrA时 ,替换多基因盒 .Southern印迹证实 ,基因破坏和基因替换是成功的 .摇瓶发酵表明 ,构建的基因工程菌株比原始菌株基础产酸率提高了 4 5
- 李永辉王世春刘云郭长江蒋与刚徐琪寿
- 关键词：RED重组系统
- 发酵液中L-色氨酸分离纯化工艺研究被引量：8
- 2007年
- 通过静态吸附实验,考察了温度、pH值对001×7阳离子交换树脂平衡吸附量的影响,并测定了吸附动力学曲线。通过动态实验,测定了动态吸附曲线和洗脱曲线。最后确定了001×7阳离子交换树脂分离纯化L-色氨酸的最佳工艺条件:用001×7阳离子交换树脂吸附L-色氨酸,以浓度为2 mol.L-1氨水进行洗脱,收集的流份经D315阴离子交换树脂脱色,浓缩结晶后得L-色氨酸成品,总提取率为73.0%。
- 武彩莲郭长江杨继军韦京豫徐琪寿
- 关键词：离子交换树脂L-色氨酸洗脱脱色
- 大肠杆菌PGDH末端缺失突变体的构建及抗反馈抑制效应分析被引量：8
- 2006年
- 为了获得具有抗反馈抑制性质的大肠杆菌磷酸甘油酸脱氢酶（PGDH,d-3-phosphoglycerate dehydrogenase,EC 1.1.1.95）,通过对其碱基序列和蛋白质结构分析,用PCR突变法构建突变酶M1（缺失第410位氨基酸）、M2（缺失407～410位氨基酸）、M3（缺失337～410位氨基酸）.M0（野生型）及各突变型基因与pET22b（＋）载体连接后,表达融合蛋白.在非变性条件下,由NTA-Ni镍离子螯合亲和层析柱纯化野生型和突变体的酶蛋白.酶活性测定结果表明,M1、M2蛋白酶均保持了原有的野生型磷酸甘油酸脱氢酶活性,且部分解除了终产物L-丝氨酸的反馈抑制作用;M3蛋白酶完全解除了终产物的反馈抑制作用,但酶本身的催化活性略有降低（为野生型的83%）.M0、M1、M2菌株PGDH与L-丝氨酸结合的Ki值分别约为7μmol/L、20μmol/L、50μmol/L,说明该酶C末端1～4个氨基酸残基对L-丝氨酸和调控区的结合有重要影响.
- 张绪梅郭长江刘云杨继军韦京豫徐琪寿
- 关键词：大肠杆菌蛋白纯化缺失突变体
- 色氨酸的生理生化作用及其应用被引量：96
- 2005年
- 主要介绍了色氨酸在人体内的生理作用、代谢途径及其在医学和工业领域的应用。
- 李剑欣张绪梅徐琪寿
- 关键词：色氨酸生理功能代谢
- 大肠杆菌色氨酸操纵子基因的克隆与表达被引量：1
- 2008年
- 目的克隆并表达大肠杆菌色氨酸操纵子基因,提高其酶活性。方法利用PCR方法,从大肠杆菌31884基因组中直接克隆出色氨酸操纵子,并将其连接到原核表达载体pET-22b(+)中,构建重组质粒pET-22b(+)-Trpoperon,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析,并测定酶活性。结果凝胶电泳可见PCR扩增产物大小约为7000bp,SDS-PAGE鉴定目的蛋白分别得到了表达,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性分别比对照提高了2.7和3.2倍。结论已成功构建了重组表达质粒pET-22b(+)-Trpoperon,邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性在大肠杆菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定了基础。
- 林维平郭长江张绪梅徐琪寿
- 关键词：克隆酶活性
