山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(BS2012NY012)
- 作品数：3 被引量：5H指数：2
- 相关作者：王金宝杜以军吴家强刘纪玉时建立更多>>
- 相关机构：山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室青岛农业大学山东省农业科学院更多>>
- 发文基金：山东省优秀中青年科学家科研奖励基金公益性行业(农业)科研专项国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- HeLa细胞Ⅰ型干扰素效应因子实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用被引量：3
- 2013年
- 本试验旨在建立一种用SYBR GreenⅠ荧光染料检测HeLa细胞Ⅰ型干扰素效应因子ISG15、ISG56、Mx1、OAS和PKR mRNA表达水平的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并在口蹄疫病毒(FMDV)L蛋白抑制Ⅰ型IFN发挥效应的信号通路中进行初步应用。利用TRIzol法提取总RNA,经Oligo d(T)15进行反转录,利用PCR扩增各段目的基因,并克隆至pMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,经鉴定为阳性的重组质粒作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR标准曲线和熔解曲线,并进行灵敏性、特异性和重复性试验。根据建立的实时荧光定量RT-PCR方法,检测FMDV L蛋白对Ⅰ型IFN效应因子的抑制效果。HeLa细胞在转染FMDV L蛋白真核表达质粒,并受到Ⅰ型IFN刺激后ISG15、ISG56、Mx1、OAS和PKR的相对表达量较转染空载体或表达GST的真核表达质粒明显降低。本试验建立了HeLa细胞Ⅰ型IFN效应因子的实时荧光定量RT-PCR检测方法,为在mRNA水平上对HeLa细胞Ⅰ型IFN效应因子的定量分析奠定了基础,并成功地初步应用于FMDV L蛋白抑制Ⅰ型IFN发挥效应的信号通路的研究中。
- 刘纪玉杜以军刘星吴家强李俊丛晓燕赵新华徐绍建孙文博时建立单虎王金宝
- 关键词：实时荧光定量RT-PCRSYBRL蛋白干扰素
- 稳定高效表达猪CD163的Marc-145细胞系的构建与鉴定
- 2015年
- 试验旨在构建一株高效表达猪CD163(pCD163)的Marc-145细胞系,为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的临床分离和疫苗生产奠定基础。根据GenBank中序列设计引物从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中扩增pCD163基因,将其插入真核表达载体pCI-neo构建真核表达质粒pCIpCD163,将该重组质粒转染Marc-145细胞,通过G418筛选、单克隆化并扩大培养筛选获得表达pCD163的Marc-145细胞系,IFA、Western blotting鉴定其表达情况。IFA结果显示,构建的pCD163-Marc细胞系中荧光明显亮于普通Marc-145细胞;Western blotting结果显示,pCD163-Marc细胞系中CD163蛋白表达量约为对照Marc-145细胞中CD163蛋白表达量的8.7倍。且该细胞系可稳定传至20代,各代次之间表达量无差异。证明高效表达猪CD163的Marc-145细胞系构建成功。
- 吴香菊李芳韬陈蕾丛晓燕孙文博于江陈智郭立辉吴家强杜以军赵孝民王金宝
- 关键词：MARC-145稳定细胞系
- 基因调控型质粒串联表达猪α、γ干扰素及其体外抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性研究被引量：2
- 2013年
- 利用兔β-Globin Intron II基因调控序列,改造真核表达载体pVAX1,构建基因调控型质粒,将猪α干扰素(pIFN-α)和γ干扰素(pIFN-γ)进行串联表达。结果表明,重组质粒pMVAX1-pIFN-α/γ表达的IFN活性相比pVAX1-pIFN-α提高了100倍,比pVAX1-pIFN-γ提高了1 000倍。体外抗病毒活性表明,pIFN-α/γ的量为100 U(稀释度1∶106)以上时,对100 TCID50的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)具有明显的抑制效果,说明串联表达的pIFN-α和pIFN-γ具有高效抗PRRSV效果。本研究将为PRRS的预防治疗提供新的思路和方法。
- 周顺刘纪玉赵红波张怡轩郭立辉吴家强时建立任素芳王金宝杜以军
- 关键词：猪Α干扰素猪Γ干扰素猪繁殖与呼吸综合征病毒抗病毒活性
