国家自然科学基金(30070853)
- 作品数：13 被引量：14H指数：3
- 相关作者：杨冬华汤绍辉黄卫周鸿科舒建昌更多>>
- 相关机构：暨南大学附属第一医院汕头大学医学院第一附属医院澳门科技大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金广东省自然科学基金广东省医学科学技术研究基金更多>>
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- 人胰岛素样生长因子ⅡP3启动子调控融合基因质粒构建的研究被引量：2
- 2006年
- 目的构建人胰岛素样生长因子Ⅱ基因(IGF-Ⅱ)P3启动子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因穿梭质粒,观察其在肝癌细胞株HepG2及宫颈癌细胞株HeLa细胞中的表达及其作用。方法应用基因重组技术,构建IGF-ⅡP3启动子驱动EGFP与HSV-tk融合表达穿梭质粒载体,脂质体转染技术将其转入HepG2及HeLa中,48h后荧光显微镜下观察荧光表达,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HSV-tk和EGFP的mRNA表达,四甲基偶氮唑蓝实验检测转染融合蛋白载体后给予不同浓度的更昔洛韦对HepG2及HeLa细胞毒作用。结果酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功;转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光;RT-PCR检测到HSV-tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达;更昔洛韦(GCV)对转染了携此质粒载体的HepG2细胞有选择性细胞毒作用,1、10、和100μg/ml3个浓度GCV作用72h后(实验均重复3次),对转染细胞的抑制率分别为19.8%±1.3%、36.2%±2.0%和48.7%±1.9%,与细胞病毒转染HepG2组(24.1%±1.9%、45.1%±1.7%、69.4%±3.6%)和此质粒转染HeLa细胞组(25.1%±1.6%、49.3%±1.1%、72.2%±2.9%)相比,差异有统计学意义(均P<0.01)。结论成功构建IGF-ⅡP3启动子驱动携带HSV-HSV-tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体,转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用,为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定基础。
- 周鸿科杨冬华汤绍辉黄卫卢筱华
- 关键词：质粒胸苷激酶
- 人肝癌胰岛素样生长因子Ⅱ基因P2,P4启动子克隆及序列分析被引量：2
- 2005年
- 目的克隆人胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)基因P2,P4启动子并进行序列分析,以明确肝癌组织中IGF-Ⅱ启动子碱基序列有无改变及其与转录调控的关系,为后续研究奠定基础。方法根据GenBank数据库提供的IGF-Ⅱ基因全序列及有关文献,应用巢式PCR扩增L-02人胎肝细胞系(正常对照)及8例肝癌组织的IGF-ⅡP2,P4启动子,并采用TOPO TA Cloning kit将PCR产物克隆入pCR2.1-TOPO T载体。目的DNA片段和阳性重组子分别通过琼脂糖凝胶电泳及直接测序鉴定。结果①L-02细胞及8例肝癌组织P2,P4启动子均扩增成功,长度分别为684 bp及1 246 bp;②8例肝癌组织P2,P4启动子碱基序列与L-02相应的DNA序列完全相同,未见突变、缺失等改变,经与GenBank数据库比较,结果完全一致。结论①成功克隆了IGF-ⅡP2,P4启动子;②本组肝癌组织中IGF-ⅡP2,P4启动子序列稳定,未见突变、缺失等改变,可能与IGF-Ⅱ异常表达的转录调控机制无关。
- 汤绍辉杨冬华黄卫舒建昌
- 关键词：肝细胞癌启动子
- HBx蛋白对IGF-II基因P4启动子活性的影响被引量：1
- 2010年
- 目的:构建乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)表达载体pEYFP-C1-X及人IGF-II基因P4启动子调控的荧光素酶报告载体pGL3-P4,并初步探讨HBx对IGF-II基因P4启动子活性的影响。方法:应用基因重组技术,将HBx基因及P4启动子分别克隆入pEYFP-C1及pGL3-Basic载体,构建重组质粒pEYFP-C1-X及pGL3-P4;将pEYFP-C1-X稳定转染HepG2细胞,进行G418筛选;将体外甲基化pGL3-P4瞬时转染HepG2-EYFP-X细胞,采用双荧光素酶实验检测P4启动子的转录调控活性。结果:(1)经酶切及测序鉴定,重组质粒中的目的片段HBx和P4启动子的大小分别为465bp及1246bp,序列与GenBank数据库一致。(2)获得了表达HBx的细胞系HepG2-EYFP-X,在荧光显微镜下呈现黄绿色荧光。(3)转染HepG2-EYFP-X细胞的甲基化P4启动子的荧光素酶活性明显高于其对照细胞HepG2-EYFP(P<0.01)。结论:HBx可增加P4启动子的转录活性。
- 汤绍辉曲春晖杨敏英罗羽宏杨冬华
- 关键词：乙型肝炎病毒X蛋白转录活性
- 人肝癌组织胰岛素样生长因子Ⅱ基因P4启动子甲基化变化及其意义被引量：3
- 2006年
- 汤绍辉杨冬华黄卫周鸿科卢筱华叶刚
- 关键词：启动子甲基化人肝癌组织P4MRNA表达量MRNA水平
- 肝癌胰岛素样生长因子II基因启动子P3甲基化的检测及意义被引量：4
- 2004年
- 目的:建立检测肝癌胰岛素样生长因子II(IGF-II)基因启动子P3甲基化状态的方法。方法:培养三株肝癌细胞系(BEL7402、SMMC7721、HepG2),选取正常肝组织3例;提取基因组DNA,亚硫酸氢钠修饰,巢式聚合酶链反应(nestedPCR)加甲基化特异性PCR(MSP)检测IGF-II基因启动子P3的甲基化状态,PCR产物经克隆、测序验证。结果:三株肝癌细胞系IGF-II基因启动子P3去甲基化,正常肝组织IGF-II基因启动子P3甲基化,目的片段无突变,甲基化修饰完全。结论:巢式PCR加甲基化特异性PCR可准确检测IGF-II基因启动子P3的甲基化状态。
- 黄卫杨冬华汤绍辉
- 关键词：启动子甲基化
- 肝癌组织胰岛素样生长因子启动子P1的序列分析
- 2004年
- 目的 :分析肝癌组织胰岛素样生长因子Ⅱ (IGF Ⅱ )基因启动子P1的基因序列。方法 :采集手术切除的肝癌组织 10例、正常肝组织 5例 ,均经病理学证实 ;提取基因组DNA为模板 ,巢式PCR扩增IGF Ⅱ基因启动子P1,扩增产物测序。结果 :肝癌组织、正常肝组织IGF Ⅱ启动子P1序列与MEDLINE提供的正常序列 (NT 0 0 93 0 8)一致。结论 :本组肝癌的IGF Ⅱ基因启动子P1无序列异常 ,肝癌发生、发展过程中IGF Ⅱ启动子P1的失活可能与基因缺失。
- 黄卫杨冬华汤绍辉
- 关键词：肝癌组织正常肝组织胰岛素样生长因子癌发生
- 携带融合基因穿梭质粒的构建及在人肝癌细胞中的表达
- 2006年
- 构建携带胸苷激酶(tk)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因穿梭质粒,并观察其在肝癌细胞系HepG2细胞中的表达。应用基因重组技术,构建EGFP与tk的融合表达穿梭质粒载体,经限制酶切鉴定和测序分析,脂质体转染将其导入HepG2中,48h后用荧光显微镜观察荧光的表达,RT-PCR法检测融合蛋白tk和EGFP的mRNA表达,四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验检测转染融合蛋白载体后不同浓度的更昔洛韦(GCV)对HepG2细胞的细胞毒作用。酶切鉴定和测序分析证实重组质粒中插入融合目的基因片断及载体DNA大小、方向和插入位点正确,在转染此穿梭质粒的HepG2细胞中检测到绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR检测到融合蛋白tk和EGFP的mRNA表达;GCV对转染了携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体有明显的细胞毒作用。成功构建携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体,转染人肝癌细胞株HepG2中tk和EGFP的独立表达没有受到影响,该载体可利用绿色荧光蛋白作为报告基因监测tk的表达并可用于肝癌的自杀基因治疗。
- 周鸿科杨冬华汤绍辉黄卫
- 关键词：胸苷激酶增强型绿色荧光蛋白穿梭质粒
- 人肝癌组织胰岛素样生长因子Ⅱ基因P3,P4启动子表达及其与p53基因突变的关系被引量：2
- 2007年
- 目的探讨人肝癌组织胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)基因P3,P4启动子表达及其与p53基因突变的关系。方法应用半定量RT-PCR、PCR、直接测序分别检测7例正常成人肝组织、23例乙型肝炎病毒阳性肝癌组织IGF-Ⅱ基因P3,P4启动子特异的转录子表达及p53基因突变状况。结果①绝大多数肝癌组织P3和P4mRNA表达量显著上调,平均值均明显高于正常成人肝组织(P<0.01);②肝癌组织p53基因的突变率为30.4%(7/23)。③23例肝癌组织中,具有p53基因突变的标本P3,P4mRNA表达水平分别明显高于无p53基因突变的肝癌组织(P<0.05)。结论①IGF-Ⅱ基因P3和P4再激活是大多数乙型肝炎病毒阳性肝癌的重要特征;②肝癌组织P3,P4mRNA显著上调与p53基因突变密切相关,后者可能是P3,P4再激活的转录调控机制之一。
- 陈潮文刘序友杨冬华汤绍辉
- 关键词：P53基因转录子
- 人胰岛素样生长因子ⅡP4启动子调控胸苷激酶载体的构建
- 2011年
- 目的探讨人胰岛素样生长因子Ⅱ（IGF-Ⅱ）P4启动子调控单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）／丙氧鸟苷（GCV）自杀基因系统体外对人肝癌细胞的选择性杀伤效应。方法用分子生物学方法构建IGF-ⅡP4启动子和巨细胞病毒启动子（CMV）调控下HSVtk与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合基因穿梭质粒，并用脂质体转染法将其转入肝癌细胞系HepG2及宫颈癌细胞系HeLa细胞中，在荧光显微镜下观察荧光表达情况。加入GCV使总浓度分别为0、1．0、10．0和100．0μg／ml，用四甲基偶氮唑盐实验检测HSV-tk／GCV系统对各种细胞的杀伤作用，用RTPCR法检测转染前后胸苷激酶（tk）和EGFPmRNA的表达情况。用方差分析进行统计学处理。结果酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功；转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光；RT-PCR检测到tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达；pDC316tkEGFP-CMV和pDC316-tkEGFPP4转染的HepG2细胞均出现明显的细胞生长抑制现象，两者转染细胞的抑制率分别为6．95％±0．67％、24．99％±1．53％、49．68％±1．68％和71．85％±3．28％，4．83％±0．35％、17．34％±1．15％、30．17％±1．30％和40．39％±0．82％，转染后者对HepG2细胞的抑制率低（F=24．055，P〈0．05），pDC316-tkEGFPCMV转染的HeLa细胞也出现明显的细胞生长抑制现象，其抑制率分别是6．36％±0．83％、23．95％±1．72％、45．13％±1．64％和69．38％±3．17％，转染质粒pDC316-tkEGFP-P4的HeLa细胞未发现明显的细胞抑制现象。结论成功构建IGF-ⅡP4启动子调控携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体，转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用，为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定基础。
- 周鸿科杨冬华汤绍辉黄卫
- 关键词：肝细胞胸苷激酶
- 人胰岛素样生长因子Ⅱ基因P1、P3启动子克隆及意义被引量：5
- 2003年
- 目的 :人胰岛素样生长因子Ⅱ (IGF -Ⅱ )基因P1、P3启动子的克隆。方法 :根据GenBank数据库提供的IGF -Ⅱ基因DNA全序列及有关文献 ,应用巢式PCR技术从L - 0 2正常人胎肝细胞系中扩增分离出P1、P3启动子片段 ,并采用TOPOTACloningkit将PCR产物克隆入pCR2 .1-TOPOT载体。结果 :经琼脂糖凝胶电泳及直接测序鉴定 ,克隆的IGF -Ⅱ基因P1、P3启动子片段碱基序列与GenBank数据库一致。结论 :成功克隆了IGF -II基因P1、P3启动子。
- 汤绍辉杨冬华舒建昌黄卫
- 关键词：克隆
