云南省科技计划项目(2006C0071M)
- 作品数：1 被引量：2H指数：1
- 相关作者：曹毅冯昌增谢月辉孟照辉更多>>
- 相关机构：贵州省烟草科学研究所中国医学科学院北京协和医学院云南大学更多>>
- 发文基金：云南省科技计划项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 果蝇吡咯啉-5-羧酸还原酶的表达、纯化及理化特点被引量：2
- 2012年
- 吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CRs)是普遍存在于原核和真核生物中的一种重要管家蛋白,其主要的功能是催化吡咯啉-5-羧酸(P5C)转化为脯氨酸,同时将NAD(P)H氧化为NAD(P)+。为揭示果蝇P5CR的聚合形式、酶学性质及晶体结构,提取了果蝇的总RNA,通过逆转录获得了cDNA,进而通过PCR获得了编码果蝇P5CR的cDNA片段;将此片段连接到pET-28a(+)载体上,在大肠杆菌(Escherichia coli)中得到了高效表达,依次经过硫酸铵分级沉淀、亲和层析及凝胶过滤层析得到了适合晶体生长的高纯度蛋白;通过EGS交联实验和凝胶过滤层析检测了P5CR在溶液中的聚合形式;应用分光光度法测定了果蝇P5CR的酶活性参数;采用悬滴气相扩散法筛选了P5CR的结晶条件并进行了优化。实验结果:(1)纯化后的蛋白样品经SDS-PAGE检测,结果显示,凝胶上已基本观察不到杂蛋白质条带,说明目的蛋白质纯度较高;(2)果蝇P5CR在溶液中的基本存在形式是十聚体,在此基础上可形成更大的聚合形式;(3)果蝇P5CR参与抗癌药物硫代脯氨酸的代谢,在该逆向反应中最适pH为高碱性,该酶在45℃的半衰期约15分钟;(4)筛选得到了果蝇P5CR的初步结晶条件(0.2mol/L Ammonium phosphate dibasic,20%PEG3350 pH 8.0)。
- 冯昌增谢月辉曹毅孟照辉
- 关键词：还原酶果蝇羧酸吡咯纯化凝胶过滤层析
