四川省学术和技术带头人培养资金(4200316)
- 作品数：13 被引量：16H指数：2
- 相关作者：陈建平刘明杰田玉李红霞姚卫更多>>
- 相关机构：四川大学绵阳市疾病预防控制中心四川省疾病预防控制中心更多>>
- 发文基金：四川省学术和技术带头人培养资金国家自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 嗜肺军团菌热休克蛋白60基因真核表达载体的构建及鉴定
- 2005年
- 目的构建嗜肺军团菌热休克蛋白60(HSP60)基因的真核表达载体pcDNA3.1/HSP60,并对其进行鉴定。方法应用聚合酶链式反应(PCR)技术从嗜肺军团菌扩增得到HSP60基因,并将其克隆至载体pUC18进行序列测定。将重组质粒pUC18/LpHSP60中的目的基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组子pcDNA3.1/HSP60,通过限制性内切酶酶切及PCR进行鉴定。结果克隆的LpHSP60基因序列与GenBank公布的一致性为98%,限制性内切酶酶切及PCR分析表明HSP60基因已成功插入pcDNA3.1中。结论成功构建了LpHSP60基因的真核表达载体,为进一步研究军团菌病HSP60基因DNA疫苗奠定了基础。
- 廖涛陈建平刘明杰
- 关键词：嗜肺军团菌热休克蛋白60真核表达载体
- 霍乱弧菌ctxB基因真核重组质粒的构建及表达
- 2006年
- 目的构建霍乱孤菌ctxB基因真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法用限制性核酸内切酶从重组质粒pET32a-ctxB上切下ctxB基因,导入真核表达载体pcDNA3·1(+),重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3·1-ctxB。用脂质体法将重组质粒pcDNA3·1-ctxB转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法对pcDNA3·1-ctxB的瞬时表达产物进行鉴定。结果约380bp的ctxB被克隆到pcDNA3·1(+)真核表达载体中,经测序无误后,用阳离子脂质体转染的方法,检测到重组质粒pcDNA3·1-ctxB在NIH3T3细胞的胞浆和胞膜上得到了表达。结论ctxB真核表达的成功构建及表达为进一步从分子水平研究霍乱肠毒素B亚单位的免疫原性及其作为佐剂的应用价值提供研究基础。
- 张莉陈建平张雷刘明杰王涛
- 关键词：霍乱孤菌真核表达
- 军团菌外膜蛋白抗原基因的克隆并在原核系统中表达被引量：1
- 2004年
- 目的 克隆军团菌外膜蛋白抗原基因 omp M,构建重组质粒 p LPM,并在原核系统中表达。方法 采用聚合酶链反应 (PCR)从军团菌基因组 DNA中扩增得到 omp M基因 ,导入载体 p UC1 8,在 JM1 0 9中表达 ,并用SDS-PAGE进行鉴定。结果 扩增出 773 bp的 omp M基因 ;构建重组质粒 p LPM;表达出 2 5 k Da的蛋白质。结论 成功扩增军团菌 omp M基因 ,构建重组质粒 p LPM,并在原核系统中得到了表达。
- 芦殿香陈建平张雷王涛刘明杰田玉陈宪
- 关键词：军团菌PCR基因表达
- 结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因真核表达载体的构建及鉴定
- 2007年
- [目的]构建结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因的真核表达载体pcDNA3.1-Rv3873,并对其进行鉴定。[方法]利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因,并将其定向克隆至原核载体pGEX-4T-1中,经测序鉴定后,将重组质粒pGEX-4T-1-Rv3873中的目的基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组子pcDNA3.1-Rv3873,通过限制性内切酶切酶及PCR进行鉴定。[结果]克隆的Rv3873基因序列与GenBank公布的一致性为100%,限制性内切酶酶切及PCR分析表明Rv3873已成功插入pcDNA3.1(+)中。[结论]成功构建了Rv3873基因真核表达载体,为进一步研究新型结核杆菌DNA疫苗奠定了基础。
- 曾林子陈建平刘成君李红霞姚卫杨志荣
- 关键词：结核分枝杆菌真核表达载体
- 嗜肺军团菌热休克蛋白60基因的克隆及序列分析被引量：1
- 2005年
- 目的获取嗜肺军团菌热休克蛋白60(HSP60)基因,并将它克隆到质粒pUC18中进行核苷酸序列分析。方法应用聚合酶链式反应(PCR)技术从嗜肺军团菌扩增得到HSP60基因,将其定向插入载体pUC18并转化大肠杆菌JM109,用限制性酶切及PCR对重组质粒进行鉴定。用双脱氧链末端终止法进行DNA序列测定,并与GenBank中报道的HSP60基因进行比较。结果成功克隆了约1647bp的HSP60基因片段,测序结果表明,所克隆的HSP60基因序列与GenBank公布的一致性为98%。结论获得了序列正确的HSP60基因,为其重组表达及相关研究奠定了基础。
- 廖涛陈建平刘明杰
- 关键词：嗜肺军团菌热休克蛋白克隆
- 重组结核分枝杆菌ESAT6-PPE68融合蛋白的制备被引量：2
- 2007年
- 目的构建结核分支杆菌esat6-ppe68融合基因及其原核表达载体,在大肠杆菌中表达融合蛋白ESAT6-PPE68。方法用基因拼接(GeneSOEing)法扩增esat6-ppe68融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGesat6-ppe68。重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后转化宿主菌大肠杆菌BL21,IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)诱导表达约69000带谷胱苷肽硫转移酶蛋白(GST)标签的rESAT6-PPE68融合蛋白,经谷胱苷肽-硫-转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化的融合蛋白,产物进行SDS-PAGE电泳、Western-blotting鉴定。结果重组质粒pGesat6-ppe68中目的基因测序结果与报道序列完全相同;在大肠杆菌中以可溶性非包涵体形式表达;表达量约占菌体总蛋白的40%,表达蛋白纯化后获得纯度为90%左右的重组蛋白;Westernblotting结果证实重组蛋白与确诊的结核病患者血清发生特异免疫反应。结论成功构建了原核表达载体pGesat6-ppe68,获得了rESAT6-PPE68融合蛋白,为rESAT6-PPE68融合蛋白在结核病诊断中的应用奠定了基础。
- 李红霞陈建平曾林子刘刚姚卫杨筠刘杨椅王涛田玉
- 关键词：结核分枝杆菌原核表达
- 嗜肺军团菌主要免疫原基因真核表达质粒的构建与表达被引量：2
- 2007年
- 目的构建嗜肺军团菌主要免疫原基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip,并观察其在真核细胞中的表达。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌ip基因,将其定向插入载体pcDNA3.1(+),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip。经限制性核酸内切酶Hind和BamH酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ip转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot分别鉴定pcD-NA3.1-ip的瞬时和稳定表达。结果成功构建了嗜肺军团菌ip基因的真核表达重组质粒。在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA3.1-ip成功转入NIH3T3细胞,并在NIH3T3细胞中得到了瞬时表达;用嗜肺军团菌兔血清抗体检测pcDNA3.1-ip稳定转染的NIH3T3细胞,在相对分子质量为29×103处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-ip在细胞内可稳定表达IP蛋白。结论本研究构建的嗜肺军团菌主要免疫原基因真核表达质粒pcDNA3.1-ip能够成功表达IP蛋白,表达的蛋白具有良好的免疫原性与免疫反应性。
- 杨志伟陈建平刘明杰张雷刘德松
- 关键词：嗜肺军团菌转染体外表达
- 嗜肺军团菌PAL、HSP60抗原基因在真核细胞中表达的实验研究被引量：1
- 2007年
- 目的研究嗜肺军团菌PAL、HSP60抗原基因在真核细胞中的表达,为嗜肺军团菌DNA疫苗的研制提供实验依据。方法将本室已构建的重组质粒pcDNA3.1-PAL和重组质粒pcDNA3.1-HSP60分别及混合转染NIH3T3细胞,通过免疫荧光和RT-PCR检测其瞬时表达和稳定表达产物。结果重组质粒pcDNA3.1-PAL、pcDNA3.1-HSP60以及混合pcDNA3.1-PAL和pcDNA3.1-HSP60转染NIH3T3细胞后均获得了有效表达。结论本研究结果为嗜肺军团菌核酸疫苗的进一步研究奠定了基础。
- 田玉陈建平张建国杨春蕾刘明杰
- 关键词：嗜肺军团菌热休克蛋白60
- 结核分枝杆菌cfp10基因的克隆及序列分析被引量：1
- 2006年
- 目的扩增结核分枝杆菌培养滤液蛋白10基因(cfp10),并将其克隆至质粒pGEX-4T-1中进行核苷酸序列分析。方法应用聚合酶链式反应(PCR)技术从结核分枝杆菌基因组DNA中扩增得到cfp10基因,将其定向插入载体pGEX-4T-1并转化大肠杆菌JM109,对重组质粒(命名为pGcfp10)进行限制性酶切分析及PCR鉴定。用双脱氧链末端终止法进行DNA序列测定,并与GenBank中报道的cfp10基因进行比较。结果成功克隆了约303bp的cfp10基因片段,测序结果表明,所克隆的cfp10基因序列与GenBank公布的一致性为100%。结论获得了序列正确的cfp10基因,为其原核表达及相关研究奠定了基础。
- 李红霞陈建平姚卫杨筠
- 关键词：结核分枝杆菌CFP10克隆
- 结核分枝杆菌cfp10-esat6融合基因原核表达载体的构建及表达
- 2007年
- 构建结核分枝杆菌cfp10-esat6融合基因及其原核表达载体,在大肠杆菌中表达融合蛋白CFP10-ESAT6。用基因拼接(GeneSOEing)法扩增cfp10-esat6融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGcfp10-esat6。重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后转化宿主菌大肠杆菌BL21,IPTG(isopropy-β-D-thiogalactoside,异丙基硫代-β-D半乳糖苷)诱导表达约42kDa带谷胱苷肽硫转移酶(Glutathione-S-TransferasesGST)蛋白标签的rCFP10-ESAT6融合蛋白,经谷胱苷肽硫转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化的融合蛋白,产物进行SDS-PAGE电泳、Western-blot鉴定。重组质粒pGcfp10-esat6中目的基因测序结果与报道序列相同;在大肠杆菌中以可溶性非包涵体形式表达;表达量约占菌体总蛋白的40%,表达蛋白纯化后获得纯度为90%左右的重组蛋白;Western印迹结果证实重组蛋白与确诊的结核病患者血清发生特异免疫反应。本研究成功构建了原核表达载体pGcfp10-esat6,获得了rCFP10-ESAT6融合蛋白,为rCFP10-ESAT6融合蛋白在结核病诊断中的应用奠定了基础。
- 李红霞陈建平刘刚姚卫杨筠刘杨椅曾林子田玉王涛
- 关键词：结核分枝杆菌原核表达
