江苏省高校高新技术产业发展项目(JHB05-45)
- 作品数：13 被引量：50H指数：4
- 相关作者：邱玉华陈永井程钢孙中文王艳茹更多>>
- 相关机构：苏州大学上海交通大学中国科学院上海生命科学研究院更多>>
- 发文基金：江苏省高校高新技术产业发展项目江苏省自然科学基金国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 抗人CD28单链抗体基因的构建及在BmN细胞和家蚕中的表达被引量：3
- 2007年
- 采用TP-PCR法,将抗人CD28单链抗体的重、轻链可变区基因和人工设计的昆虫杆状病毒多角体蛋白基因(ph)偏好的连接肽序列,拼接成抗人CD28单链抗体(抗CD28-ScFv)基因,并将其插入昆虫杆状病毒转移载体pBacPAK8的ph启动子,构建成重组转移载体pBacPAK8/CD28-ScFv。为便于表达产物的纯化,在CD28-ScFv的C端增加了6×Histag序列。通过脂质体介导法将重组转移载体pBacPAK8/CD28-ScFv和线性化病毒Bm-BacPAK6共转染BmN细胞,经空斑分析和蓝白斑筛选,获得重组杆状病毒Bm-BacPAK6 CD28-ScFv。将重组病毒Bm-BacPAK6 CD28-ScFv感染BmN细胞和5龄家蚕,SDS-PAGE和Western Blotting分析表明,在分子量约为28kD处有一表达带。BmN细胞的表达始于24h,表达峰在72h,96h时表达量开始下降,而5龄家蚕的表达始于48h,表达峰在120h。结果证明,抗人CD28单链抗体基因在BmN细胞和家蚕中得到了特异性表达。上述研究成果为抗人CD28基因工程抗体的研制奠定了基础。
- 朱艳郑峰丰陈永井邱玉华朱江
- 关键词：CD28单链抗体家蚕真核表达
- CD80鼠-人嵌合抗体的CHO细胞表达及体外生物学功能的初步研究被引量：12
- 2009年
- 目的:CHO细胞表达抗人CD80鼠-人嵌合抗体ch4E5,并研究其在体外阻断CD80介导的共刺激信号转导的生物学功能。方法:构建含有嵌合重、轻链基因的表达载体pIRES/ch4E5;表达载体先转染293T细胞,FCM检测到ch4E5抗体的瞬时表达后,表达载体再转染CHO细胞,构建稳定表达细胞株CHO-ch4E5;ProteinG亲和层析法从CHO-ch4E5细胞无血清培养上清中纯化ch4E5抗体,FCM检测ch4E5抗体对膜型CD80的识别;以丝裂霉素处理的正常人外周血单核细胞PBMCs为刺激细胞,以异体正常人外周血淋巴细胞PBLs为反应细胞,用MTT法分析ch4E5抗体的阻断作用。结果:ch4E5抗体在293T细胞的瞬时表达于48小时达到高峰,上清与L929-B7-1细胞结合率为96.0%;CHO-ch4E5细胞持续表达ch4E5抗体,其培养上清与L929-B7-1细胞结合率为95.7%;3天培养上清中,ch4E5抗体的产率约为5.56mg/L;ch4E5抗体和L929-B7-1、Daudi、Sub-T细胞结合率分别为94.1%、25.7%、23.5%;ch4E5抗体可以阻断CD80介导的共刺激信号转导,抑制异体PBLs的体外增殖。结论:在CHO细胞中成功表达了抗人CD80鼠-人嵌合抗体ch4E5,在体外该嵌合抗体具有亲本抗体阻断CD80介导的共刺激信号的生物学活性。
- 徐耀瑜胡玲玲陈永井程钢罗先富孙杰刘玉华王艳茹陈明心邱玉华
- 关键词：CD80嵌合抗体阻断作用
- 利用家蚕-HyNPV表达系统表达鼠抗人CD28分子单链抗体被引量：2
- 2009年
- 人CD28分子是T细胞表面的最重要的协同刺激分子。将抗人CD28的鼠源单链抗体基因(mouse anti-human CD28-ScFv)亚克隆至杂交病毒HyNPV Bac-to-Bac系统供体质粒pFastBacHTa中,获得重组转移载体pFast-BacHTa CD28-ScFv,并转化大肠杆菌(E.coli)DH10Bac获得重组杆粒rBacmid CD28-ScFv,脂质体介导转染Sf9昆虫细胞后获得重组杆状病毒rBV CD28-ScFv。该重组杆状病毒注射接种于家蚕5龄起蚕,经SDS-PAGE和Westernblotting分析表明,CD28-ScFv在家蚕体内得到了表达,即:人CD28单链抗体通过HyNPV这一宿主范围扩大的新型杂交杆状病毒表达载体在家蚕中获得了表达。
- 黄光镁邱玉华陈永井郑小坚吴小锋胡静平朱江
- 关键词：家蚕生物反应器单链抗体
- 老年人T细胞膜型CD28及血清中可溶性CD28的表达及其意义被引量：10
- 2007年
- 分析老年人(年龄在60岁以上)外周血T细胞膜型CD28(mCD28)及血清中可溶性CD28(sCD28)的表达水平,探讨该分子在老年人免疫功能改变中的意义。分别收集肝素抗凝及不抗凝的老年人外周血,抗凝血经分离获取单个核细胞,间接免疫荧光及流式细胞仪分析,老年人T细胞mCD28的阳性表达率为男性(41.56%±11.23%)及女性(42.97%±12.02%)。与年轻人[男性(61.51%±17.45%)及女性(62.38%±16.22%)]相比,差别具有显著性(P<0.01)。酶联免疫吸附法(ELISA)检测,老年人血清中sCD28的含量为男性(1.08±0.45)及女性(0.98±0.47)ng/ml,与青年人[男性(0.55±0.16)及女性(0.52±0.13)ng/ml]相比,差别具有显著性(P<0.01)。老年人T细胞mCD28的表达水平下降,而血清中sCD28的含量升高。
- 石云杰顾国浩史进方钱齐宏孙中文程钢孙玮丽邱玉华
- 关键词：老年人免疫衰老
- 抗人CD86嵌合抗体对B淋巴瘤细胞株Raji生长抑制及杀伤作用研究被引量：4
- 2009年
- 目的:研究CD86嵌合抗体ch1D1对天然高表达CD86分子的人恶性B淋巴瘤细胞株Raji增殖抑制及杀伤效应。方法:经流式细胞术检测ch1D1对Raji细胞表面CD86分子的识别;经ch1D1(终浓度10μg/ml)处理Raji细胞,MTT法检测对Raji细胞增殖的抑制效应;流式细胞术检测ch1D1诱导Raji细胞表面FasL及Fas的表达;MTT法检测ch1D1介导的外周血单个核细胞(PBMCs)对Raji为靶细胞的ADCC效应。结果:ch1D1可特异性识别Raji细胞表面CD86分子,阳性结合率为97.5%。ch1D1对Raji细胞增殖的抑制率为27.1%,较鼠源性亲本抗体1D1组(抑制率为38.8%)略下降,但两者统计学比较无差异(P>0.05)。与CD80嵌合抗体ch4E5联合应用抑制率可达56.3%,明显高于ch1D1单独作用的抑制率(P<0.05)。ch1D1作用4小时后,Raji细胞表达FasL水平开始升高,处理72小时阳性表达率为6.8%,较亲本抗体1D1组(阳性表达率3.2%)升高,但统计学比较无显著差异(P>0.05);经ch1D1作用24小时,Raji细胞Fas表达水平开始上调,阳性率为6.1%,较1D1组(阳性表达率4.8%)升高,但无统计学差异(P>0.05)。与ch4E5联合应用均较ch1D1单独作用Fas及FasL的表达水平升高,但统计学比较仍无显著差异(P>0.05)。经ch1D1处理4、24、48、72小时,介导PBMC对Raji细胞杀伤率分别为25.0%、52.0%、71.3%、72.7%,与人IgG1及鼠源亲本抗体对照组相比均明显升高,具有显著差异(P<0.05)。结论:抗人CD86嵌合抗体可抑制高表达CD86分子的肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡,与嵌合抗体Fc段介导的ADCC效应具有协同抗肿瘤作用。
- 刘玉华孙杰胡玲玲王艳茹马鸿冰程钢徐耀瑜杜阳阳陈明心邱玉华
- 关键词：CD86嵌合抗体淋巴瘤凋亡ADCC效应
- 抗人B7-1人-鼠嵌合抗体体内外抑瘤作用研究被引量：2
- 2015年
- 目的研究抗人B7-1人-鼠嵌合抗体ch-4E5对高表达B7-1分子的人恶性B淋巴瘤细胞株Raji的抑瘤作用。方法自行制备ch-4E5,经流式细胞术(FCM)分析ch-4E5对Raji细胞膜型B7-1分子的识别及共育后细胞表面Fas及Fas L表达的改变,继而又经MTT法检测细胞增殖的抑制效应;以人外周血PBMC为效应细胞,Raji为靶细胞,分析ch-4E5介导的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC);将Raji细胞经ch-4E5处理后接种Balb/c裸鼠,观察裸鼠成瘤时间并计算成瘤率。结果 ch-4E5与Raji细胞的阳性结合率为97.9%;该抗体可上调Raji表面Fas及Fas L的表达,其阳性表达率分别为15.8%及16.9%,与人Ig G1同型对照组5.1%和2.2%比较具有统计学意义(P<0.01);ch-4E5对Raji细胞增殖的抑制率为39.17%(P<0.01);介导的最大杀伤率为56.47%(P<0.01);经ch-4E5处理的Raji细胞接种Balb/c裸鼠,90 d的观察期内均未见肿瘤形成,而对照组成瘤率高达80%。结论抗人B7-1人-鼠嵌合抗体对高表达B7-1的肿瘤细胞具有抑瘤作用。
- 王艳茹邱玉华
- 关键词：B7-1嵌合抗体B淋巴瘤
- 抗人B7-2单链抗体基因的构建及其在大肠杆菌中的表达被引量：2
- 2010年
- 在成功建立稳定分泌鼠抗人B7-2杂交瘤细胞株基础上,扩增并克隆出该单克隆抗体的重链(VH)和轻链(VL)可变区基因。通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法,在VH和VL可变区基因之间引入连接肽(Gly4Ser)3,体外构建抗人B7-2单链抗体(B7-2 ScFv)基因。为便于表达产物的纯化,在抗人B7-2 ScFv的C端增加了6×His tag序列。将其克隆至表达载体pET32a并在大肠杆菌中进行原核表达。SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,抗人B7-2 ScFv在大肠杆菌BL21(DE3)菌中获得表达,重组融合蛋白的相对分子量约为43 kD,表达产物以不溶性包涵体形式存在,经溶解包涵体,体外复性和Ni-NTA亲和柱纯化,获得了高纯度的抗人B7-2 ScFv,纯化蛋白得率约16.2%。成果为抗人B7-2单链抗体的生物学活性研究和抗肿瘤药物开发奠定了基础。
- 董海辉邱玉华陈永井胡静平黄光镁朱江
- 关键词：单克隆抗体单链抗体B7-2原核表达
- 鼠抗人B7-2单克隆抗体的研制及生物学特性研究被引量：11
- 2006年
- 以天然高表达膜型B7-2分子的人恶性B淋巴瘤经胞株Daudi和B7-2基因转染细胞株L929-B7-2为免疫原及检测细胞株,采用B细胞杂交瘤技术建立了1株稳定分泌抗人B7-2单抗的杂交瘤,命名为6A5。快速定性试纸法鉴定6A5属小鼠IgG1亚类。经体内诱生腹水法制备单抗,小鼠腹水形成的阳性率为80%,腹水的收获量平均为5.9 ml/只小鼠。经免疫亲和层析法纯化,腹水中抗体蛋白的得率为1.1 mg/ml。采用间接免疫荧光法及流式细胞仪分析,单抗6A5与L929-B7-2、PBTC、Raji和Daudi的阳性结合率分别为99.9%、4.6%、90.6%和99.1%。将6A5(终浓度为5μg/ml)加入到Daudi细胞的培养体系中,经显微镜观察及MTT法分析,6A5对Daudi细胞的生长在24 h内具有抑制作用(P<0.05)。以丝裂霉素处理的L929-B7-2为刺激细胞,PBTC为反应细胞,加入6A5共同培养。经MTT法分析,6A5能阻断B7-2介导的协同刺激信号,抑制PBTC增殖(P<0.05)。提示6A5是一株功能性抗体,在B7-2分子相关的基础和应用研究中具有重要的价值。
- 陶然石云杰孙中文马泓冰徐颖程钢孙玮丽周立峰邱玉华张学光
- 关键词：B7-2基因转染细胞协同刺激分子单克隆抗体腹水
- 抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建及瞬时表达被引量：2
- 2007年
- 目的构建及瞬时表达抗人CD28鼠-人嵌合抗体。方法采用基因工程技术,从分泌鼠抗人CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞株(克隆号:2F5)中克隆出抗体重链和轻链可变区基因及相应信号肽编码序列。分别与人免疫球蛋白IgG1恒定区重、轻链基因拼接,构建含有重组基因的pIRES表达质粒pIRES/h2F5。转染293T细胞并用抗性药物G418选择培养。采用流式细胞术,检测瞬时转染细胞后嵌合抗体的表达情况。结果抗人CD28鼠人嵌合抗体得到表达并能与CD28分子特异性结合。结论抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建和瞬时表达是成功的,为后续构建稳定分泌抗人CD28鼠-人嵌合抗体的CHO基因转染细胞株奠定了基础。
- 程钢陈永井马震宇费敏孙中文徐耀瑜胡玲玲邱玉华
- 关键词：CD28单克隆抗体嵌合抗体
- 转染人CTLA-4细胞的对树突状细胞B7分子表达的影响被引量：1
- 2007年
- 从PHA活化的人外周血T细胞中抽提总RNA,经RT-PCR扩增出CTLA-4的全长基因,构建逆转录病毒载体pEGZ-Term/CTLA-4,经PCR及电泳鉴定后感染包装细胞293T。收集培养上清感染L929细胞。用Zeocin选择培养。经免疫荧光及流式细胞术进行筛选,获取稳定表达CTLA-4分子的细胞株CTLA-4/L929。将CTLA-4/L929经丝裂霉素处理后与体外细胞因子诱导的树突状细胞共同孵育。分别于24、48及72h,用直接免疫荧光法和流式细胞术分析树突状细胞B7-1和B7-2分子的表达。研究结果显示,构建的重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/CTLA-4的PCR产物长约700 bp,与人CTLA-4基因的长度一致。经Zeocin选择及多次亚克隆化培养,CTLA-4基因转染细胞CTLA-4/L929稳定表达膜型CTLA-4分子。以其为刺激细胞与树突状细胞共同培养后,可明显下调树突状细胞B7-1的表达,但对B7-2的表达没有影响。本研究获得的CTLA-4基因转染细胞株,为进一步探讨CTLA-4及其配基分子在免疫应答中的作用与机制提供了手段。
- 孙玮丽陈永井孙中文徐耀瑜胡玲玲张学光邱玉华
- 关键词：CTLA-4B7基因转染共刺激分子树突状细胞
