教育部科学技术研究重点项目(207082)
- 作品数：8 被引量：17H指数：3
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- 相关机构：南方医科大学宁夏医科大学更多>>
- 发文基金：教育部科学技术研究重点项目国家自然科学基金更多>>
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- 骨骼肌成肌干细胞体外三维与平面培养的比较研究被引量：1
- 2010年
- 目的比较三维与平面培养C2C12细胞形态及功能差异。方法I型胶原和Matrigel Matrix修饰Sylgard 184铸槽和普通培养皿,分别接种C2C12细胞悬液,细胞增殖至80%融合时换含2%马血清的DMEM/F12诱导分化获取成熟的肌管;倒置显微镜观察肌管形态,RT-PCR和免疫荧光检测。结果Sylgard 184铸槽表面的C2C12细胞诱导分化5d出现多核、极性肌管,17d时肌管增粗成熟、极性平行,融合形成肌组织类似物,厚0.15mm,有自主收缩性;扫描电镜见肌管之间排列紧密、重叠,具有三维性;而平面培养肌管小而排列紊乱。RT-PCR表明三维培养的MyoD、Myogenin mRNA表达更为显著;Myogenin、Desmin、F-actin、MHC和nAChR蛋白检测显示,极性肌管内荧光蛋白的表达更密集。结论三维培养更有利于成肌细胞的体外极性分化和肌管间细胞连接的形成,分化肌管的存活时间较长,有利于成肌分化因子和收缩蛋白的表达,是骨骼肌的发生发育、应力加载和骨骼肌肌病良好的体外研究模型。
- 艾鹤英秦建强余磊廖华
- 关键词：C2C12细胞
- 失神经萎缩肌组织中卫星细胞池的耗竭与Pax7的相关性研究被引量：6
- 2009年
- 目的探讨长期失神经骨骼肌在反复增殖分化过程中,肌卫星细胞池耗竭可能的信号通路。方法选用2月龄SD雄性大鼠9只,体重180～200g。以大鼠右侧为实验侧,制备腓肠肌失神经支配模型;左侧为对照侧,分离显示坐骨神经后缝合肌肉皮肤。观察大鼠一般情况,于术后3、7、21d各取3只大鼠,切取两侧腓肠肌进行大体观察后,行Pax7和MyoD免疫荧光染色观察及mRNA表达检测。结果9只大鼠术后均存活。实验侧后肢僵直,活动受限;对照侧肢体活动自如。术后各时间点实验侧腓肠肌均出现不同程度萎缩;对照侧腓肠肌较饱满有光泽。荧光染色观察显示,随失神经时间延长,实验侧MyoD阳性细胞数逐渐增多,21d达高峰,与对照侧比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。实验侧Pax7阳性细胞逐渐降低,3、7d与对照侧比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。实验侧MyoDmRNA表达逐渐升高,21d达高峰,各时间点实验侧均显著高于对照侧(P<0.05);实验侧Pax7mRNA表达逐渐降低,仅出现于3、7d,与对照侧比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论长期失神经肌萎缩引发的Pax7短暂上调提示卫星细胞池耗竭的原因之一在于细胞难以返回静止状态。
- 廖华王齐徐达传邱小忠余磊欧阳钧
- 关键词：失神经肌萎缩肌卫星细胞MYOD
- 失神经萎缩肌组织成分对成肌细胞性能影响的实验研究被引量：1
- 2008年
- 目的:探讨长期失神经萎缩骨骼肌组织成分对体外培养成肌细胞的性能影响。方法:①获取长期失神经支配肌萎缩模型大鼠的腓肠肌,无菌条件下清洗、剪碎、匀浆、过滤,收集上清液;②收集Schwann细胞的体外培养基;③体外培养C2C12成肌细胞系,扩增传代并分组:A.对照组,常规培养,无任何处理因素;B.添加Schwann细胞培养基;C.添加萎缩肌匀浆液。倒置显微镜观察3组细胞的形态特征,免疫荧光检测C2C12细胞MyoD和Myogenin的差异表达。结果:倒置显微镜下,各组细胞贴壁良好,A、C组形态无差异,未见分化肌管;B组于培养48h后细胞变纤细,可见肌管形成。荧光染色证实,培养24h后,3组均出现MyoD阳性细胞,C组阳性细胞数量明显多于A、B组;72h时,3组均可见Myogenin阳性细胞,B组阳性细胞数量明显多于A组,C组阳性细胞数量稀少。结论:长期失神经萎缩肌组织成分能够促进成肌细胞的增殖与活化,但抑制活化成肌细胞的进一步分化成熟。
- 廖华徐达传邱小忠余磊欧阳钧
- 关键词：失神经肌萎缩MYODMYOGENIN
- 不同频率周期性应力加载对体外多层肌管极性及分化的影响被引量：2
- 2012年
- 目的探讨不同频率的周期性应力加载对体外培养多层肌管极性与分化的影响,筛选优化的肌组织体外应力加载培养条件。方法体外培养C2C12成肌细胞于Sylgard 184铸型凹槽诱导分化形成多层肌管组织,采用自制体外细胞拉伸仪,对培养并分化的肌管进行间歇性应力加载:加载幅度10%,加载频率分别为0(A组)、0.25(B组)、0.50(C组)、1.00 Hz(D组),加载时间3次/d,每次1 h。连续加载5、7、10 d时,观察各组肌管形态;RT-PCR和实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,QRT-PCR)分析检测成肌相关基因成肌分化抗原(myogenic differentiationantigen,MyoD)、肌细胞生成素(Myogenin)、结蛋白(Desmin)、肌球重链蛋白(myosin heavy chain,MyHC)mRNA的表达差异。结果倒置相差显微镜观察示,应力加载促进各组肌管的极性融合及数量增加,其中B组加载培养7 d时,多层肌管排列紧密,极性显著。加载条件能促进成肌相关基因mRNA的表达:组内随加载时间延长,各组MyoD的mRNA表达逐渐下降,7、10 d与5 d比较差异均有统计学意义(P<0.05);Myogenin、Desmin、MyHC的mRNA表达呈先升高后降低趋势,以7 d表达量最高;B组除7 d与10 d Desmin的mRNA表达比较差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各时间点比较差异均有统计学意义(P<0.05)。同时间点随加载频率增加,MyoD、Myogenin、Desmin、MyHC的mRNA表达呈先升高后降低趋势,以B组表达量最高;除5 d B、C组Desmin和10 d A、B组MyHC的mRNA表达比较差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各组与B组各相关基因mRNA表达比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论低频(0.25 Hz)、适时(7 d)的周期性应力加载有利于生长于Sylgard 184弹性材料表面的多层肌管极性分化,但随着应力加载时间延长,肌管的老化加速。
- 黄维一刘幸卉陈荣冯利强廖华余磊曾慧君
- 关键词：分化肌管体外实验
- C2C12细胞诱导构建三维骨骼肌组织被引量：4
- 2010年
- 目的利用修饰并铸型后的Sylgard 184凹槽与C2C12细胞复合培养、诱导分化,获取三维极性骨骼肌组织。方法 Sylgard 184双组分以10∶1的比例均匀混合并倒板,室温下静置固化并对其表面压槽铸型,Hank液冲洗凹槽,Matrigel和胶原的混合液均匀铺被凹槽底部,置生物安全柜待细胞基质自然干燥、紫外线照射消毒1h以上时接种C2C12细胞悬液,细胞增殖约80%汇合时改用分化培养基进行分化诱导,倒置显微镜下观察肌管的分化状态,RT-PCR方法检测肌管内myogenin和desmin基因mRNAs的表达,免疫荧光检测生肌转录因子myogenin和desmin蛋白的表达,扫描电镜观察肌管形态和肌管间的连接。结果 C2C12细胞在Sylgard 184弹性体铸型压槽中培养分化7d后,倒置显微镜下可见肌管呈极性分化,且肌管之间融合紧密;21d后,扫描电镜检测可见肌管之间排列紧密且相互重叠,形成膜样结构,厚度可达0.15mm,具有三维性;RT-PCR、免疫荧光检测证实极性分化肌管内具有myogenin和desmin的阳性表达。结论修饰并铸型的Sylgard 184凹槽具有一定的方向引导效应,能促进C2C12细胞分化形成多核肌管,且肌管呈极性重叠排列,形成三维极性骨骼肌组织结构。
- 王齐廖华秦建强余磊艾鹤英汪海仪邱小忠
- 关键词：MATRIGEL肌组织反转录-聚合酶链式反应C2C12细胞
- 不同基质材料修饰的Sylgard184与C2C12细胞的相容性被引量：3
- 2009年
- 目的筛选能提高硅酮橡胶弹性体（Sylgard184）与C2C12相容性的理想基质材料。方法Sylgard184双组分以10∶1的比例均匀混合,倒入6孔板的其中4孔,室温下静置固化,其余2孔做为空白对照培养组（A组）;固化后的Sylgard184表面依次经过以下处理：I型胶原包被（B组）、层黏连蛋白包被（C组）、多聚赖氨酸包被（D组）;未经包被（E组）,每组共6个样本。在不同基质材料修饰的Sylgard184表面培养C2C12细胞,利用倒置显微镜观察5组C2C12细胞的增殖、分化状态,流式细胞术（FCM）检测增殖培养48h后C2C12细胞的分裂增殖情况,RT-PCR检测增殖和分化培养48h后C2C12细胞内MyoD、myogenin mRNA的表达。结果Sylgard184材料存在细胞毒性,E组接种的C2C12细胞在24h内全部漂浮死亡;D组的大多数细胞出现死亡,仅少数贴壁存活;而B、C两组材料包被后明显减少Sylagard184的毒性,增强其表面与C2C12细胞的相容性,且C组细胞处于合成期的百分比以及增殖期的MyoD和分化期Myogenin基因mRNA的表达水平均显著高于A、B两组（P〈0.05）。结论经层黏连蛋白包被后的Sylgard184表面更有利于C2C12细胞的增殖及分化活性的表达。
- 王齐廖华秦建强余磊邱小忠于巧莲艾鹤英
- 关键词：细胞基质相容性C2C12细胞
- miRNAs与骨骼肌成肌干细胞
- 2009年
- miRNA的研究起始于stRNA（small temporal RNA）,1993年Lee等在秀丽隐杆线虫（C．elegan）中通过基因筛选和定位克隆的方法发现了lin-4。在2000年,Reinhart等在人类和果蝇中发现第二个异时性开关miRNA-let-7；2001年有3个实验室发表研究数据,他们各自从线虫、果蝇和人体克隆出几百个类似C．elegan的lin-4的miRNA基因,这些非编码miRNA被统称为miRNA。国内外学者们通过分子克隆和生物信息学等方法,已在动物、植物、病毒及单细胞生物体中鉴定出大约5000余种miRNAs,并且建立了miRNA数据库（http：//microrna．sanger．ac．uk/）,为世界各国学者开展miRNA研究提供资源共享。
- 艾鹤英廖华
- 关键词：MIRNAS骨骼肌秀丽隐杆线虫RNA基因定位克隆基因筛选
- 力学刺激对体外培养成肌细胞作用机制的研究进展
- 2007年
- 在体组织通常处于复杂的生长环境，其中力学刺激的作用极大地影响着组织的形态结构和功能。力学拉伸是维持细胞生存和生长的重要细胞外刺激，它能够调节细胞的新陈代谢和基因表达过程，在成肌细胞的激活、增殖与分化中扮演重要角色㈣。为克服骨骼肌组织工程研究中成肌细胞的诱导分化、三维培养及组织构建等方面的困难。使体外构建的骨骼肌更接近于在体的肌肉组织，应力拉伸在诱导成肌细胞的激活、增殖及分化方面的作用机制日益受到相关研究者的重视，并进行了大量的研究报导，本文就该领域的研究进展予以综述。
- 王齐廖华
- 关键词：细胞作用机制成肌细胞体外培养诱导分化生长环境
