国家自然科学基金(30070928)
- 作品数：12 被引量：49H指数：5
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- 巨细胞病毒嗜肝细胞性和肝细胞感染模型的建立被引量：3
- 2007年
- 目的确定巨细胞病毒(CMV)体外能否直接攻击肝细胞,并建立肝细胞感染模型。方法①人肝细胞系感染:用人CMV(HCMV)AD169毒株感染正常人肝细胞系(L-02)和人胚肺成纤维细胞(HELF)与L-02共培养细胞,HC-MV感染的HELF细胞为阳性对照;②原代鼠肝细胞(PML)感染:用重组鼠CMV(MCMV)感染PML细胞。光镜观察细胞病变(CPE),电镜观察病毒颗粒,间接免疫荧光(IFA)法检测HCMV抗原;原位杂交法检测MCMVIE基因。PML性质经观察其特征性超微结构和检测培养上清白蛋白水平予以鉴定。结果在PML细胞纯度>95%(培养第8天)时感染病毒,3d后>80%细胞出现典型CPE;电镜下胞核和胞质内见大量病毒颗粒;病毒IE基因检测呈阳性。HELF细胞可被HCMV感染;而L-02细胞无论是单独,还是与HELF共培养,其病毒标志物均呈阴性,细胞结构保持正常。结论原代鼠肝细胞体外可受到MCMV直接感染,为CMV肝炎的体外研究提供成功的肝细胞感染模型;而正常人肝细胞系不能感染HCMV,推测其表面HCMV受体发生改变或丢失。
- 聂兴草方峰李红董永绥甄宏李革
- 关键词：巨细胞病毒肝细胞细胞嗜性
- 人血清对大蒜新素细胞毒性及其抗人巨细胞病毒效应影响的实验研究被引量：3
- 2004年
- 目的 探讨人血清干预对大蒜新素细胞毒性及其抗人巨细胞病毒 (HCMV)效应的影响。方法 将系列浓度大蒜新素与不同浓度血清共同作用于人胚肺成纤维细胞 ,观察细胞增殖活力 (MTT法 )、细胞形态和超微结构及HCMV蚀斑抑制率的改变。结果 ①不加血清时 ,细胞对大蒜新素最大耐受浓度 (MTC)为 9 6 μg/ml;加入 2 0 %灭活血清后 ,MTC增至 2 1μg/ml。②血清干预前 ,2 1μg/ml大蒜新素使 6 0 %细胞坏死 ,胞质与胞核疏松混浊、呈筛状 ,内质网、线粒体弥漫性肿胀空泡变明显 ,异染色质减少 ;血清干预后 ,细胞形态与超微结构均明显改善 ,尤其在干预后 4 8h ,细胞超微结构与正常细胞相似。③ 2 0 %血清干预提高细胞对大蒜新素的最大耐受浓度 ,后者对HCMV抑制率由干预前的 6 5 92 %提高至 82 98%。结论 2 0 %血清干预可明显改善大蒜新素的细胞毒性、保护细胞超微结构 ;增加大蒜新素用量 ,进而提高其抗HCMV效应。
- 罗丹方峰甄宏刘志峰李革聂兴草崔雯
- 关键词：大蒜新素人巨细胞病毒细胞毒性超微结构细胞形态学
- 体外三步法诱导胚胎干细胞定向生成神经干细胞的实验研究被引量：3
- 2005年
- 目的探讨体外定向诱导胚胎干细胞(embryonicstemcells,ESCs)生成高纯度神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)的方法。方法模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,以脑星形胶质细胞为支持细胞,用全反式维甲酸(All-transretinoicacid,ATRA)等分三阶段诱导ESCs定向生成NSCs。形态学观察及畸胎瘤形成试验对ESCs的全能性进行鉴定;形态学观察结合免疫组织化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志OCT-4和神经干细胞标志Nestin蛋白和(或)基因表达对诱导全过程进行动态监测;NSCs分化试验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测。结果⑴体外培养的小鼠ESC-D3细胞在胚胎成纤维饲养层细胞上连续传代培养,仍保持向三胚层分化的能力;⑵随着诱导的进行,OCT-4表达逐渐减弱并消失,而Nestin表达逐渐增强,经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的Nestin阳性细胞;⑶所诱导生成的细胞在NSCs选择性培养基中反复传代,仍表现为Nestin阳性和具有生成神经球的能力,在含血清培养基中可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞。结论采用星形胶质细胞作为诱导基质,模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导ESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力。
- 周玉峰方峰付劲蓉董永绥李革甄宏易文龙向稚丹
- 关键词：神经干细胞胚胎干细胞三步法NESTIN表达脑星形胶质细胞体外定向诱导
- 用重组病毒株建立鼠巨细胞病毒性肝炎的实验模型被引量：8
- 2002年
- 用插入LacZ基因的重组病毒株建立BALB/c小鼠巨细胞病毒 (murinecytomegalovirus ,mCMV)性肝炎模型。20只BALB/c甲基强的松龙免疫抑制小鼠 ,腹腔接种1×106PFU病毒悬液 ,动态观察血单个核细胞和组织中mCMV感染及肝组织病理变化。结果 :①mCMV感染小鼠血单个核细胞中X -gal染色阳性细胞在48h时开始出现 ,第3天有所减少 ,在第6天达到高峰;②肝、肺、肾组织病毒感染72h后可见 ,在第12天斑点数最多 ,以肝组织病毒感染多见;③肝组织病变在病毒感染后96h开始出现 ,在第12天达到高峰。提示 :利用重组mCMV建立的mCMV性肝炎小鼠模型 ,在感染后2周仍保持较高感染水平 ,为CMV的研究提供了一个良好的实验模型。
- 刘志峰方峰董永绥李革聂兴草
- 关键词：鼠巨细胞病毒动物模型病毒性肝炎婴幼儿肝脏损害
- 大蒜新素抑制人巨细胞病毒即刻早期抗原表达的实验研究被引量：7
- 2003年
- 目的 :通过研究大蒜新素对人巨细胞病毒即刻早期抗原 (HCMVIEA)的抑制作用 ,探讨大蒜新素体外对HCMV感染的预防、阻断和治疗效应及其机制。方法 :采用细胞形态观察和MTT比色法检测大蒜新素的细胞毒性。以流式细胞术定量检测和比较大蒜新素不同剂量 ,不同处理时间 (2 4 ,4 8,72 ,96h)以及病毒感染不同阶段 (病毒吸附前、吸附时和吸附后 )应用大蒜新素时HCMVIEA表达水平变化。结果 :人胚肺成纤维细胞对大蒜新素的最大耐受浓度为 9.6 0mg·L-1。病毒吸附后持续用药可显著抑制HCMVIEA的表达 ,用药 72hHCMVIEA抑制率达 89.3% ;大蒜新素预处理细胞后感染病毒 ,HCMVIEA抑制率为 2 8.6 % ;药物与病毒吸附同时应用 ,即刻早期抗原 (IEA)抑制率仅为 10 .3%。结论 :大蒜新素体外持续用药可显著抑制HCMVIEA的表达 ;其预防作用较弱 ;即时抑制效应不明显。大蒜新素对IEA表达的明显抑制可能是大蒜新素抗HCMV效应的主要作用机制之一。
- 舒赛男方峰董永绥
- 关键词：大蒜新素人巨细胞病毒流式细胞术
- HCMV免疫逃避分子机制研究进展被引量：12
- 2004年
- 人巨细胞病毒 (humancytomegalovirus,HCMV)可在体内长期持续潜伏存在 ,在免疫功能低下时又复燃。HCMV在与人类共进化的过程中 ,形成了多种分子机制逃避机体免疫系统的监视 ,从而在体内长期持续潜伏存在 。
- 周玉峰方峰
- 关键词：HCMV免疫逃避人巨细胞病毒分子机制免疫功能
- 人巨细胞病毒体外感染人胚肺成纤维细胞后相关基因的表达被引量：1
- 2010年
- 目的研究人巨细胞病毒（HCMV）体外感染人胚肺成纤维细胞（HELF）后即刻早期基因（UL122和UL123）、早期基因（UL54）和晚期基因（UL83）的表达情况,探讨其时序性表达关系。方法用高感染复数的HCMV AD169病毒株感染体外培养的HELF,在感染后0.5 h、2.0 h、4.0 h、6.0 h、12.0 h和24.0 h收获细胞,Trizol法提取各样本总RNA,并进行反转录反应,实时荧光定量PCR方法检测各时刻UL122、UL123、UL54和UL83基因mRNA表达量。结果 1.HCMV UL122 mRNA在感染后0.5 h即开始表达,在感染后2.0~4.0 h mRNA表达量迅速增高,然后进入平台期（6.0~12.0 h）,此后略有升高;除感染后6.0 h和12.0 h外,余各时间点其表达差异均有统计学意义（Pa〈0.01）。2.HCMV UL123 mRNA在感染后0.5~6.0 h表达量迅速升高,此后增速变缓,略有升高。除12.0 h与6.0 h和24.0 h表达量无差异外,余各时间点差异均有统计学意义（Pa〈0.01）。3.HCMV UL54 mRNA在感染后0.5~2.0 h表达量较少,4.0~6.0 h明显增多,12.0~24.0 h持续增高。除0.5 h与2.0 h、6.0 h与12.0 h表达无显著差异外,余不同时间点差异均有统计学意义（Pa〈0.05）。4.HCMV UL83 mRNA在感染后0.5~4.0 h呈低水平,6.0 h后明显增多,此后持续增高;除前3个时间点外,余均有统计学差异（Pa〈0.05）。结论 HCMV AD169株各基因mRNA呈级联时序性表达,UL122和UL123、UL54及UL83 mRNA开始表达的时相分别为感染后0.5~4.0 h、2.0~4.0 h和6.0~12.0 h,与各基因间连锁调控表达相一致。
- 张菊向稚丹王慧舒赛男方峰
- 关键词：人巨细胞病毒即刻早期基因人胚肺成纤维细胞
- 大蒜新素对人巨细胞病毒即刻早期、早期和晚期基因转录水平的影响被引量：1
- 2011年
- 目的:研究大蒜新素对人巨细胞病毒(HCMV)即刻早期(ie)、早期(e)和晚期(l)基因在转录水平的影响,探讨大蒜新素抗HCMV效应的作用机制。方法:建立HCMV AD169株(MOI=2.5)感染细胞和大蒜新素(9.6 mg.L-1)处理感染细胞模型,并用相应剂量(2.3 mg.L-1)的更昔洛韦(GCV)作比较,用实时荧光定量PCR方法检测各组细胞感染后0.5,2,4,6,12,24 h病毒ul122,ul123,ul54,ul83 mRNA水平的动态变化。结果:大蒜新素处理组ul122,ul123 mRNA的表达量始终明显低于感染对照组(P<0.05),而更昔洛韦处理组ul122 mRNA在0.5～6 h与病毒对照组无明显差异。大蒜新素对AD169ul122,ul123 mRNA的抑制率在感染后24 h分别为75.2%,70.4%。2药物处理组ul54 mRNA表达量始终低于病毒对照组(P<0.05),大蒜新素和更昔洛韦对ul54 mRNA的抑制率在感染后24 h分别为45.4%,27.2%。在感染后6 h各组ul83 mR-NA表达明显增多,以病毒感染对照组变化最为明显。大蒜新素和更昔洛韦对ul83 mRNA的抑制率在感染后24 h分别为45.9%,26.2%。结论:大蒜新素可显著抑制HCMVAD169毒株ie基因(ul122和ul123)的转录,导致其mRNA表达明显降低,对e基因(ul54)和l基因(ul83)转录水平亦有所抑制,表明病毒ie基因可能是大蒜新素抗HCMV作用的主要环节。
- 张菊向稚丹刘兴楼王慧李革方峰
- 关键词：人巨细胞病毒大蒜新素实时定量PCR
- 大蒜新素预防和治疗鼠巨细胞病毒性肝炎的实验研究被引量：6
- 2003年
- 目的 探讨大蒜新素在体内对鼠巨细胞病毒 (m urine cytom egalovirus,MCMV)感染小鼠的预防及治疗作用。方法 建立 BAL B/c小鼠 MCMV重组病毒 (插入 L ac Z基因 )性肝炎模型 ,采用 X- gal染色测定β- gal在肝、肾及肺组织中的表达。 70只雌性 BAL B/c小鼠随机分为大蒜新素预防 +治疗组 (n=2 0 ) ,大蒜新素治疗组(n=2 0 ) ,更昔洛韦治疗组〔6 0 m g/(kg· d) ,n=10〕,安慰剂组 (n=10 )及空白对照组 (n=10 )。其中前两组又各均分为低、高剂量组〔2 5 ,75 m g/(kg· d)〕,检测血浆丙氨酸转氨酶 (AL T)水平和评估肝组织组织学活动性指数(HAI) ,并用原位杂交法检测肝组织中 MCMV DNA水平。结果 大蒜新素预防 +治疗组及治疗组与安慰剂组相比较 ,AL T、肝脏 HAI评分及 MCMV DNA杂交的积分光密度均明显降低 (P<0 .0 5 ) ,与更昔洛韦治疗组相比无显著差异 ;大蒜新素预防用药及加大用药剂量并不能显著降低 AL T、肝脏 HAI评分及 MCMV DNA积分光密度水平。结论 大蒜新素能减轻 MCMV性肝炎模型鼠肝功能损害 ,改善肝脏病理变化和降低肝组织内病毒 DNA负荷量 ,其治疗效果与更昔洛韦无显著差异 ,大蒜新素预防用药及加大用药剂量不能增加其病毒抑制效应。
- 刘志峰方峰董永绥李革
- 关键词：大蒜新素巨细胞病毒性肝炎小鼠原位杂交
- 大蒜新素对巨细胞病毒感染细胞周期蛋白基因表达谱的影响被引量：6
- 2003年
- 目的 探讨人巨细胞病毒 (humancytomegalovirus,HCMV)对感染细胞周期蛋白基因表达谱的影响及大蒜新素的干预效应。方法 利用基因芯片技术对比分析大剂量大蒜新素处理正常细胞和感染细胞 (MOI=2 .5 ) 72h以及同期培养的感染和正常细胞周期相关蛋白基因 (2 39条 )表达谱的变化。结果 感染细胞有 2 4条 (10 .0 4 % )基因发生有意义的差异性表达 ;其中 9条表达增加 ,15条表达降低。大蒜新素对 11条HCMV感染所致表达改变的基因无影响 ;使HCMV感染下调作用消除的基因有 11条 ;使HCMV感染上调作用消除的基因有 2条。另外 ,药物对感染细胞和正常细胞基因表达均有影响的有 2条 ;仅引起正常细胞基因表达改变的有 3条。结论 HCMV感染使部分细胞周期相关蛋白基因差异性表达可能是HCMV导致宿主细胞周期紊乱的原因之一。大蒜新素至少可使HCMV所致 13条基因差异性表达作用消除 ,提示药物干预了病毒对细胞周期的影响。
- 聂兴草方峰董永绥刘志峰甄宏李革
- 关键词：大蒜新素巨细胞病毒感染表达谱基因芯片
