重庆市卫生局科研项目(20111025)
- 作品数：3 被引量：9H指数：2
- 相关作者：周建中何泉张绍城汪德强陈检更多>>
- 相关机构：重庆医科大学附属第一医院重庆医科大学更多>>
- 发文基金：重庆市卫生局科研项目国家临床重点专科建设项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定被引量：2
- 2012年
- 目的:表达和纯化重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,并初步鉴定其生物学活性。方法:利用重叠延伸PCR方法使基因重组获得目的基因片段,插入带有GST标签的原核高效可溶性表达载体pEGX-6P-1中,构建重组表达质粒pEGX-6P-1-SAK-HC,将重组表达质粒转化大肠杆菌B834,经IPTG诱导目的蛋白表达;对融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱(GST)亲和层析柱及DEAE离子交换柱纯化,用PreScission蛋白酶切除GST标签,SDS-PAGE分析该融合蛋白的表达量和纯度,应用纤维蛋白平板溶圈法测定评价其生物学活性。结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实,目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量(Mr)为36 000;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,体外实验显示其纤溶活性为9.4×104IU/mg。结论:获得了可溶性的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,且其纤溶活性与尿激酶标准品相当。为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础。
- 陈检杨可郭珍张阳丽张绍城杨伟赵沙沙何泉汪德强周建中
- 关键词：重组葡激酶融合蛋白表达纯化体外活性
- RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白原核表达、纯化及鉴定被引量：3
- 2015年
- 目的构建RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达融合蛋白,纯化并初步鉴定其生物学活性。方法利用重叠延伸PCR获得目的融合基因片段RGD-r SAK-α1M,插入带有His-GST标签的原核高效可溶性表达载体PEGX-6P-1中。经酶切鉴定后,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导目的蛋白表达,经Ni+亲和层析柱纯化后用3C蛋白酶切除重组蛋白的His-GST标签,再利用DEAE离子交换柱和分子筛纯化蛋白。最后应用纤维蛋白平板溶圈法和血小板聚集抑制试验分别测定评价重组融合蛋白的溶栓活性和抗血小板聚集作用。结果 1)成功构建了RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白。2)实现了目的融合蛋白在大肠杆菌上清液中的高效表达,并纯化了融合蛋白。3)体外实验表明纯化后的融合蛋白纤溶活性同尿激酶标准品无明显差异。4)融合蛋白抗血小板聚集作用较单纯重组葡激酶明显提高。结论经文献检索确认为首次获得了纯化的RGD-重组葡激酶-人α微球蛋白融合蛋白,并验证了其纤溶活性和尿激酶标准品无明显差异,而抗血小板聚集作用较单纯重组葡激酶增强,为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础。
- 苟冶然龙小滨白磊何泉陈检张绍城汪德强周建中
- 关键词：重组葡激酶RGD融合蛋白抗血小板聚集
- 葡激酶研究进展被引量：4
- 2014年
- 葡激酶是由金黄色葡萄球菌分泌的新一代天然的纤溶酶原激活剂,具有高效的溶栓活性和纤维蛋白特异性。进入机体后引起的免疫反应是限制其临床使用的主要原因,近年来生物工程技术的发展为解决这些问题提供了新的重要途径。现将从结构特点、溶栓机制、免疫原性及分子结构改造等方面重点介绍葡激酶的研究进展。
- 苟冶然周建中
- 关键词：葡激酶结构特点免疫原性
