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国家自然科学基金(30270984): 作品数：9 被引量：111H指数：7; 相关作者：王琴宁宜宝范学政王在时陈振海更多>>; 相关机构：中国兽医药品监察所中国农业大学军事医学科学院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划国家科技重大专项更多>>; 相关领域：农业科学生物学更多>>

9株猪瘟分离毒株的致病特性被引量：9: 2007年; 采用9株临床表现强、中、低致病特点的猪瘟野毒分离株第3代细胞毒作为种毒,按3mL/头剂量分别注射猪瘟抗原及抗体阴性猪,再用上一代传代猪发病后的血毒作为下一代接毒用种毒接种试验猪1头或2头,或上一代传代猪发病后,同圈放入1头或2头试验猪进行同居感染.如此进行,GDGZ1/95、BJCY1/96和JL1/94传至8代;FJFQ1/99传至7代;HeBHH1/95、HeNBY1/96、BJTX3/96、GXBH1/98和HeNXH2/98传至3代.结果显示:上述分离株传至3～5代过程中均表现出毒力增强的趋势,从3～5代传代到8(7)代的过程中毒力进一步增强并保持稳定,且均超过了标准石门强毒株的发病特点.所有试验猪均出现较典型的猪瘟临床症状,解剖后均表现出不同程度的病理变化,死后或解剖后的各种脏器经HCFA检查均为强阳性,这种现象进一步证实了猪是猪瘟病毒的敏感动物,各毒株之间毒力没有明显差异.对其中7株分离株传代血毒部分代次E2基因主要区域进行序列分析,结果仅GDGZ1/95株从F1～F8代中的F6代有2个核苷酸的差异,引起1个相应氨基酸的变异,其余毒株的不同代次没有碱基发生变异,初步说明猪瘟病毒基因型表现相对的稳定性.; 王琴宁宜宝赵耘王在时张广川范学政宋立秦玉明沈青春丘惠深余兴龙吕宗吉徐兴然涂长春; 关键词：猪瘟病毒毒力致病特性

构建表达猪瘟病毒E0基因的重组杆状病毒被引量：4: 2006年; 为了得到可溶性重组猪瘟病毒E0蛋白并便于观察重组蛋白的表达情况，将增强型水母绿色荧光蛋白基因（EGFP）与E0基因相连插入昆虫杆状病毒转移载体中，与线性杆状病毒DNA共转染Sf9细胞后通过噬斑纯化得到纯的重组杆状病毒，将其感染Sf9细胞制备P1种子液，同时用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况，剔除表达效果差的重组杆状病毒。再用P1种子液感染Sf9细胞制备高效价的P2种子液。通过病毒液的梯度稀释和噬斑测定，确定P2种子液的病毒滴度达1．14×10^7pfu／mL。将P2种子液以MOI5～10接种指数期SD细胞．3d后呈现出最强的荧光。重组杆状病毒在Sf9细胞中的初步成功表达为进一步制各重组E0糖蛋白．研究E0蛋白的结构与功能、免疫诊断新方法和猪瘟基因工程疫苗奠定基础。; 陈振海王琴范学政宁宜宝王在时夏春; 关键词：猪瘟病毒重组杆状病毒

猪瘟病毒流行病学、病原致病特性及猪瘟综合防制研究被引量：47: 2006年; 猪瘟是由猪瘟病毒引起猪的高度致死性、接触性传染病,严重危害全球养猪业的重要传染病,也是我国计划要消灭的重大动物疫病之一。近年流行态势十分复杂,本文就CSF的流行情况、病原致病特征及综合防治技术研究等方面进行全面概述,并为猪瘟的防制提出具体实施方案。; 王琴; 关键词：猪瘟猪瘟病毒防制

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立被引量：11: 2005年; 表达猪瘟病毒保护性抗原E0蛋白用以建立猪瘟抗体诊断方法,在标记疫苗(Marker vaccine)的研制和应用上具有重要的血清学鉴别功能,对于监测猪瘟病毒的流行情况和疫苗免疫情况及制定免疫程序具有重要作用。将猪瘟兔化弱毒株(HCLV)E0 基因分别插入原核表达质粒pGEX4T, pET30, pMAL p2X 中,并分别以BL21 和BL21 codonplus(DE3) RP, BL21(DE3)和BL21 codonplus(DE3) RP,TB1 和BL21 codonplus(DE3) RP为表达菌株。通过摸索IPTG诱导浓度,诱导温度,菌体收获时间,确定E0 基因能在pGEX4T/ BL21 codonplus(DE3) RP和pMAL p2X/ BL21 codonplus(DE3) RP中获得高效表达,表达产量分别占菌体总蛋白的15%和30%,表达的重组蛋白主要为包涵体形式。分别采用B per试剂和超声波裂解配以曲通尿素对包涵体进行洗涤两种方法在pGEX表达系中取得了较好的效果。使用分步透析法对变性的包涵体进行复性,将复性蛋白过GST亲和层析柱得到纯化的GST E0融合蛋白。以GST E0融合蛋白为诊断抗原,通过摸索抗原包被浓度,抗体血清稀释倍数初步建立了用间接ELISA检测猪瘟血清E0抗体的方法,为进一步开发猪瘟抗体检测试剂盒奠定基础。; 陈振海王琴范学政宁宜宝王在时沈青春夏春; 关键词：猪瘟兔化弱毒原核表达包涵体间接ELISA

猪瘟病毒石门强毒株和兔化弱毒疫苗株E2蛋白抗原结构域差异研究: 为研究猪瘟SM株强毒株和HCLV株E2蛋白主要抗原结构域在分子水平和免疫水平上的差异,用PCR技术从重组质粒分别扩增了SM株和HCLV株E2基因的主要抗原结构域ABCD和C片段,分别克隆于pMAL-p2X载体中,经PCR...; 徐和敏徐璐范学政王琴; 关键词：猪瘟病毒 E2蛋白; 文献传递

绿色荧光蛋白基因与猪瘟兔化弱毒疫苗株E2基因在杆状病毒中的融合表达被引量：8: 2005年; 为了研究猪瘟病毒E 2糖蛋白的立体结构及生物学特性,将增强型荧光蛋白基因(EGFP)和猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)E 2基因经PCR扩增后克隆至pB lueB acH is2A质粒,与杆状病毒DNA共转染后经PCR鉴定获得了含有EGFP和HCLV E 2融合基因(GFPTE 2)的重组杆状病毒rBACTE 2-339,并将其感染sf9细胞后在荧光显微镜下观察到了亮绿色荧光,说明融合基因已初步表达。; 范学政王琴陈振海王在时赵耘宁宜宝; 关键词：猪瘟病毒 E2基因杆状病毒

猪瘟病毒E0基因在CHO细胞中的表达: 2005年; 将EGFPE0融合基因插入哺乳动物细胞表达载体pCI-dhfr中,构建重组质粒pCI-EGFPE0。将重组质粒转染CHO(dhfr-),在荧光显微镜下观察到少数细胞呈现绿色荧光,表明转染成功。通过MTX加压筛选后,在荧光显微镜下观察到多数细胞呈现强绿色荧光,表明重组融合蛋白EGFPE0在CHO细胞中得到大量表达。高效表达重组融合蛋白细胞克隆的获得为进一步大量制备可溶性的猪瘟病毒E0糖蛋白、制备其单抗筛选抗原表位及研究E0蛋白的生物学功能奠定基础。; 陈振海范学政夏春王琴宋立王在时宁宜宝; 关键词：猪瘟病毒 CHO细胞

猪瘟病毒石门株E2基因4个抗原结构域的原核表达被引量：9: 2006年; 目的对猪瘟病毒石门株E2基因进行原核表达,以期获得可溶性表达产物,为检测猪瘟抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。方法用PCR技术扩增了重组S21质粒载体上的猪瘟病毒石门株E2基因的4个主要抗原结构域ABCD,A1A2,B和C。分别将4个片段克隆于pMAL-p2X载体中,经PCR、双酶切和测序鉴定,E2基因的4个主要抗原结构域片段的位置、大小和读码框均正确。将4个片段分别转化到表达菌TB1、BL21、BL21-CodonPlus(DE3)-RP和BL21(DE3)中,共得到16株重组表达菌,用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析。结果E2基因的4个主要抗原结构域均可在这4种表达菌中表达,但以BL21-CodonPlus(DE3)-RP的表达效果最好,可表达出可溶性并且产量较高的目的蛋白。免疫印迹结果表明,表达的目的蛋白可以被猪瘟阳性血清和针对E2蛋白的单克隆抗体所识别。结论只表达目的基因的抗原结构域,可以缩短表达片段的长度,有利于获得可溶性目的蛋白,并且具有良好的血清学反应的特异性。; 徐璐范学政王琴蒋春燕宁宜宝王泰健; 关键词：猪瘟病毒 E2基因

国外猪瘟病毒实验室诊断、流行病学以及标记疫苗研究进展被引量：19: 2004年; 常用于检测猪瘟病毒的实验室诊断方法是免疫组化和病毒分离培养。随着分子生物学的发展 ,先后建立了一系列检测病毒蛋白的ELISA方法以及病毒基因组的RT PCR方法。标记疫苗是目前猪瘟疫苗发展的趋势。目前已经完成E2亚单位标记疫苗及重组活疫苗效率的测定 ,均能显著减少疫苗免疫猪群中猪瘟病毒的水平及垂直传播 ,同时通过血清学方法能区分疫苗免疫猪与自然感染猪。; 赵耘秦玉明张广川; 关键词：猪瘟病毒流行病学标记疫苗

猪瘟石门株E2基因4个抗原结构域的原核表达: 用RT-PCR技术扩增了重组S21质粒载体上的猪瘟石门株E2基因的4个主要抗原结构域ABCD,A1A2,B和C。分别将4个片段克隆于pMAL-P2X载体中,经PCR、双酶切和测序鉴定,E2基因的4个主要抗原结构域片段的位...; 徐璐范学政王琴蒋春燕宁宜宝王泰健; 关键词：猪瘟病毒原核表达; 文献传递

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