“十五”国家科技攻关计划(2003BA712A03-04)
- 作品数：6 被引量：47H指数：4
- 相关作者：洪涛王健伟屈建国郭丽徐樨巍更多>>
- 相关机构：中国疾病预防控制中心首都医科大学附属北京儿童医院卫生部更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 双抗体夹心酶联免疫吸附实验检测诺如病毒被引量：3
- 2008年
- 诺如病毒属于杯状病毒科，是引起急性非细菌性胃肠炎的主要病原，广泛分布于世界各地。虽然诺如病毒胃肠炎是温和的、自限性的疾病，但是它发病率高，感染广泛，导致住院和死亡人数的增加。危害人类的诺如病毒可分为GGI和GGII两个遗传组（genogroup），近来的研究表明，GGI和GGII至少分别由14和17个遗传型（genotype）组成。目前全世界范围内流行的诺如病毒毒株绝大部分是GGII组，GGI在我国很少见，因此，GGII组应为诺如病毒的主要防控对象。
- 郭丽周红莉田蓉江涛屈建国计融王健伟洪涛
- 关键词：诺如病毒
- 人诺如病毒衣壳蛋白的密码子优化及在昆虫细胞中的表达被引量：16
- 2006年
- 诺如病毒是当前在中国引起腹泻的主要人类杯状病毒,其中GGII4、GGII1和GGII3等为主要的流行遗传型。为了提高诺如病毒衣壳蛋白的表达量,我们将其编码基因按杆状病毒喜用密码子进行了优化设计和人工合成。以杆状病毒为载体,在昆虫细胞Sf9中对密码子优化后的诺如病毒GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型衣壳蛋白基因进行了表达。结果显示,与野生型基因相比,经过密码子优化的基因在昆虫细胞中的表达水平得到明显提高,并可装配成病毒样颗粒。重组杆状病毒感染Sf9细胞72h表达量达到高峰。这些结果的取得,为我国人杯状病毒免疫学检测试剂和疫苗的开发打下了基础。
- 郭丽周红莉屈建国王健伟徐樨巍洪涛
- 关键词：诺如病毒衣壳蛋白杆状病毒载体病毒样颗粒
- 截短型A组轮状病毒VP6在E.coli中的高效表达被引量：1
- 2006年
- 目的：研究A组轮状病毒（RV）组特异性抗原（VP6）片段的表达，为RV免疫检测技术提供材料。方法：以pcDNA3．1．VP6为模板，通过PCR扩增得到VP6的截短突变体编码基因VP6．1，将其插入谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合表达载体pGEX-5X，在E．coli中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（WIG）诱导表达。对表达产物进行SDS．PAGE和Western blot分析。通过改变宿主菌、培养基、IPTG浓度和培养温度等条件，提高目的蛋白的可溶性表达水平，使用GST-Sepharose 4B亲合层析进行初步纯化。结果：选定VP6氨基酸12-143片段为目的蛋白，PCR扩增其396bp的编码基因片段，构建出pGEX．5X．VP6．1。将该重组质粒转化E．coli后，SDS．PAGE和Western blotting分析均显示，含有截短VP6蛋白的重组融合蛋白GST：：VP6-1在E．coli中获得高效表达，约占菌体总蛋白的30％。该蛋白主要以包涵体形式存在，经条件优化，最终通过低浓度IPTG、低温诱导提高重组蛋白的可溶性表达水平，GST亲和层析可对其进行初步纯化。结论：VP6．1蛋白在E．coli中可被高效表达和纯化，为下一步制备抗VP6的特异性单克隆抗体并用于免疫检测打下基础。
- 王志宇王健伟何深一吴围屏韩金祥洪涛
- 关键词：轮状病毒属原核细胞基因表达
- 荧光定量RT-PCR在轮状病毒检测中的应用被引量：5
- 2006年
- 目的:建立轮状病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,用于检测临床腹泻样本。方法:使用Taqman探针技术,建立轮状病毒VP6特异的荧光定量RT-PCR体系。与WHO推荐的轮状病毒检测方法ELISA平行检测,对该体系的检测范围、灵敏度、特异性等参数进行评价。并将该体系用于临床腹泻样本。结果:该荧光定量RT-PCR体系具有高度灵敏度和特异性,线性范围宽,最低可检出1TCID50/ml。对113份临床腹泻样本的平行检测结果显示,该荧光定量RT-PCR体系与ELISA的检出率差异无统计学意义(χ2=0.41,P>0.5),可同样用于临床样本检测。结论:成功建立了轮状病毒荧光定量RT-PCR体系,该体系灵敏、特异、重复性好,可用于临床检测。
- 王志宇王健伟何深一孟红韩金祥洪涛
- 关键词：实时逆转录聚合酶链反应轮状病毒属聚合酶链反应
- 诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定被引量：9
- 2006年
- 目的制备诺如病毒衣壳蛋白特异性单克隆抗体,为诺如病毒的快速检测及致病机制的研究提供实验材料。方法用分别表达GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型诺如病毒衣壳蛋白的重组腺病毒联合免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,获得分泌高滴度针对衣壳蛋白的杂交瘤细胞株,测定单抗免疫球蛋白亚类及单抗效价,用间接ELISA、间接免疫荧光和Western-blot检测单克隆细胞株的特异性。结果通过细胞融合和克隆化,筛选出4株分泌抗衣壳蛋白的杂交瘤细胞株V1E、V1E9、V1D6和V6D6。间接ELISA、免疫荧光和Western-blot检测结果表明,V1E和V1E9可以与GGII4型诺如病毒衣壳蛋白发生特异性反应,V1D6和V6D6可以同时与GGII1、GGII3、GGII4和GGII7型诺如病毒衣壳蛋白发生特异性反应。结论获得了诺如病毒特异性单克隆抗体,为制备免疫诊断试剂盒及致病机制的研究奠定了基础。
- 郭丽周红莉江涛王敏计融王健伟洪涛
- 关键词：诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体
- 检测粪便中GGⅡ型诺如病毒Real-time RT-PCR方法的建立被引量：16
- 2006年
- 诺如病毒是世界急性胃肠炎的重要病原之一。为加强其控制，通过序列比对设计出针对GGⅡ型诺如病毒保守序列的特异性引物与探针，建立了TaqMan Real-time RT-PCR方法。结果显示，此方法对诺如病毒核酸检测高度特异，与轮状病毒、腺病毒、甲型肝炎病毒等无交叉反应，最低检出限可达10^2拷贝，线性范围为100～100拷贝，标准曲线的相关系数为-1．00。针对标准品质粒检测的批内实验变异系数为0．28％～1．63％（n=6）、批间实验为0．28％～1．05％（n=3），对同一样品分6次进行RNA提取和逆转录，其变异系数为3增8％。对212份临床腹泻标本分别用常规RT-PCR和本文建立的TaqMan Real-time PCR进行检测，发现后者检出率略高于前者。这些结果提示此研究建立的诺如病毒的TaqMan Real-time RT-PCR检测方法可用于临床腹泻粪便标本的检测。
- 司红丽王健伟徐樨巍王建华屈建国洪涛
- 关键词：REAL-TIMERT-PCR人类杯状病毒诺如病毒
