广西壮族自治区科技攻关计划(0815009-3-6)
- 作品数:8 被引量:93H指数:6
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- 相关机构:广西兽医研究所广西大学更多>>
- 发文基金:广西壮族自治区科技攻关计划广西壮族自治区自然科学基金国家百千万人才工程更多>>
- 相关领域:农业科学生物学更多>>
- Ⅰ群禽腺病毒五邻体蛋白间接ELISA检测方法的建立被引量:11
- 2012年
- 为建立一种简便、快速检测Ⅰ群禽腺病毒(FAVI)抗体的间接ELISA方法,以表达和纯化的FAVI五邻体重组蛋白作为抗原,优化反应条件,建立了FAVI间接penton-ELISA抗体检测的方法。抗原最佳包被浓度为1.5μg/孔,最适包被条件为37℃,2h后4℃过夜;血清最佳稀释度为1∶100;酶标二抗的最佳工作浓度为1∶2000;ELISA阴、阳性临界值为0.335。用penton-ELISA方法检测100份鸡血清样品,阳性率为41%。
- 罗思思谢芝勋谢志勤刘加波庞耀珊邓显文谢丽基范晴
- 关键词:ELISA
- Ⅰ群禽腺病毒SYBR GreenⅠ荧光PCR检测方法的建立被引量:22
- 2008年
- 根据GenBank中Ⅰ群禽腺病毒六邻体基因的保守序列设计了1对引物,建立了检测Ⅰ群禽腺病毒12个血清型的SYBR GreenⅠ荧光PCR方法。用Ⅰ群禽腺病毒阳性样品进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示。该方法可检测到每个反应相当于1×10^2个拷贝的标准品DNA,与鸡减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、传染性腔上囊炎病毒和传染性支气管炎病毒等非Ⅰ群禽腺病毒不发生交叉反应,具有良好的重复性。对保存的3份Ⅰ群禽腺病毒的细胞培养物进行荧光定量PCR检测,结果都为阳性,检测的病毒含量为1×10^6~1×10^8拷贝/μL。表明.建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上Ⅰ群禽腺病毒感染的检测。
- 文艳玲谢芝勋王莹谢丽基
- 关键词:SYBR荧光定量PCR
- Ⅰ群禽腺病毒五邻体基因的克隆及原核表达被引量:17
- 2011年
- 根据GenBank中I群禽腺病毒(AAV)基因组序列,设计了1对特异性引物。以CELO毒株基因组DNA为模板,通过PCR扩增出结构蛋白五邻体基因(penton),将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1的EcoR I和Xho I位点,构建了原核表达载体pGEX-penton。将其转化到感受态细胞DH5α中,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析,获得了45.9 ku的融合蛋白。用不同的IPTG浓度和时间诱导表达,得出诱导的最佳IPTG浓度为1.5 mmol/L,最佳时间为4 h。用尿素提取包涵体表达产物,得到penton纯化蛋白,浓度为2.98 mg/mL。经Western-bolt分析,该蛋白具有良好的反应原性。
- 罗思思谢芝勋邓显文刘加波庞耀珊谢志勤谢丽基彭宜
- 关键词:克隆PENTON原核表达
- Ⅰ群禽腺病毒33K基因的原核表达与鉴定被引量:1
- 2012年
- 33K蛋白是Ⅰ群禽腺病毒(fowl adenovirus groupⅠ,FAVⅠ)的非结构蛋白,在感染的过程中起重要作用。为了构建原核表达载体pGEX-33K作为诊断抗原,本研究根据GenBank中FAVⅠ33K基因序列,设计1对特异性引物。用PCR方法扩增目的片段,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组质粒pGEX-33K。将其转化大肠杆菌感受态细胞DH5α,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,pGEX-33K表达的分子量为36.7KD,表达产物主要以可溶性的形式存在于菌体中;最佳IPTG诱导浓度为0.75mmol/L,最佳诱导时间为4h;经Western Blot鉴定,pGEX-33K重组蛋白可与FAVⅠ阳性血清发生特异性反应,为FAVⅠ抗体ELISA鉴别诊断试剂盒的研究奠定基础。
- 罗思思谢芝勋刘加波谢丽基庞耀珊邓显文谢志勤范晴彭宜
- 关键词:原核表达
- Ⅰ群禽腺病毒分离鉴定及hexon基因的序列分析被引量:26
- 2012年
- 为调查禽腺病毒的感染状况,2008—2010年从广西南宁市活禽市场采集样品259份,通过SPF鸡胚传代增殖,经PCR鉴定,92份为禽腺病毒阳性,阳性率为35.5%(92/259)。选取不同年份的8株进行免疫琼脂扩散、血凝性、致细胞病变、形态学和鸡胚致病性试验。结果:8株均与Ⅰ群禽腺病毒阳性血清反应,不能凝集鸡红细胞,病毒粒子具有腺病毒典型特征,可致鸡胚肝细胞变圆、折光性增强,使鸡胚发育不良。将克隆的8株hexon基因进行序列比对及遗传进化分析,显示均与Ⅰ群禽腺病毒同源性最高,亲缘关系最近。结果表明,8株分离株均为Ⅰ群禽腺病毒。
- 罗思思谢芝勋邓显文刘加波庞耀珊谢志勤谢丽基彭宜范晴
- 关键词:HEXON
- Ⅰ群禽腺病毒环介导等温扩增检测方法的建立被引量:24
- 2010年
- 根据Ⅰ群禽腺病毒Hexon基因保守区序列,设计了一套特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了一种适用于Ⅰ群禽腺病毒的LAMP快速检测方法。经检测,该方法的敏感性可达1×101copies/μL;对Ⅰ群禽腺病毒12个血清型的检测结果均为阳性,而对产蛋下降综合征病毒(EDSV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、禽传染性法氏囊病病毒(IBDV)和禽传染性支气管炎病毒(IBV)的检测结果均为阴性;分别用建立的LAMP方法与常规PCR方法对24份临床疑似样品进行检测,结果检出阳性率分别为58.3%和37.5%。表明建立的LAMP方法简便、快速、灵敏、特异性高,可用于Ⅰ群禽腺病毒感染的快速诊断。
- 唐熠谢芝勋熊文婕刘加波庞耀珊邓显文谢志勤谢丽基
- 关键词:环介导等温扩增
- Ⅰ群禽腺病毒100K蛋白主要抗原区基因片段的表达及鉴定被引量:3
- 2012年
- 利用PCR技术对Ⅰ群禽腺病毒(FAVⅠ)100K蛋白主要抗原区片段进行扩增,得到约1062bp的基因片段;将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,经测序及序列分析确证其正确插入到表达载体,成功构建重组表达载体pGEX-100K。重组质粒转化大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导表达,对表达的蛋白用SDS-PAGE电泳和Western-blot分析。结果表明,100K蛋白主要抗原区基因片段得到良好的表达,表达的蛋白以可溶形式存在,分子质量约为64.5ku,与预测值相符;表达的100K蛋白与FAVⅠ阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性,为FAVⅠ诊断试剂盒的研制奠定基础。
- 罗思思谢芝勋刘加波谢丽基庞耀珊邓显文谢志勤范晴彭宜
- PCR-RFLP技术对Ⅰ群禽腺病毒12个血清型毒株的分型鉴定被引量:17
- 2009年
- 应用扩增Ⅰ群禽腺病毒(AAV)Hexon基因A片段和B片段的2对引物,对Ⅰ群AAV的12个血清型毒株进行了PCR扩增。结果扩增出的A片段大小为1 219 bp,B片段大小为1 350 bp。对A片段用限制性内切酶HaeⅡ进行酶切,结果得到6种不同的RFLP图谱;对B片段进行HaeⅡ酶切,结果得到9种不同的RFLP图谱。综合分析A片段和B片段的PCR-RFLP结果,能鉴别Ⅰ群AAV的12个血清型。结果表明,建立的PCR-RFLP具有快速、简单、特异、灵敏等优点,可作为Ⅰ群AAV流行毒株血清型的快速分型工具。
- 唐熠谢芝勋熊文婕刘加波庞耀珊邓显文谢志勤谢丽基