广西壮族自治区自然科学基金(0991007Z)
- 作品数：2 被引量：4H指数：1
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- 奶牛乳腺特异性表达人溶菌酶基因载体的构建与表达
- 2011年
- 为探讨应用转基因动物技术降低奶牛乳腺炎发病的可行性,参照人溶菌酶(human lysozyme,hLZ)基因序列(NM_000239.2)设计引物,采用RT-PCR方法从人胎盘组织中成功扩增克隆了406bp的hLZ基因成熟肽片段。应用娟姗牛酪蛋白乳腺特异表达调控元件,经过多步酶切、连接、转化、筛选、鉴定,构建成奶牛乳腺表达hLZ的载体pBCN5.2-hLZ-1.1pA-EGFP-neo(13.6kb)和pBCN-3.8-hLZ-1.1pA-EGFP-neo(12.2kb)。将构建的2个载体瞬时转染Bcap细胞,24h后可观察到EGFP的表达;通过实时定量PCR检测比较2个载体hLZ的表达丰度,结果,相对表达量分别为0.89±0.04和0.62±0.05。将线性化的pB-CN5.2-hLZ-1.1pA-EGFP-neo载体转染Bcap细胞,筛选后获得阳性细胞克隆,纯化阳性细胞总蛋白进行SDS-PAGE分析,与空白对照相比,检测到14ku的新蛋白条带。Western-blot分析中亦出现14ku的特异性条带。证实构建的载体能够正常表达hLZ基因,这为进一步研究获得自然抵抗乳腺炎的转基因奶牛奠定了工作基础。
- 刘庆友刘晟王丹李辉李湘萍罗婵陆凤花石德顺
- 关键词：奶牛乳腺特异性表达人溶菌酶基因转基因载体
- 不同精子处理对应用ICSI-Tr技术生产转基因水牛胚胎效率的影响被引量：4
- 2011年
- 本文主要探讨了不同精子处理对应用显微授精介导(intracytoplasmic sperm injection-mediated trans-genesis,ICSI-Tr)生产转基因水牛胚胎效率的影响。本试验以p18T-BCN5.2-IFN-1.1pA-EGFP为载体,比较了精子的不同处理方式(NaOH和冻融)、NaOH处理精子不同时间(5min,10min,20min,30min和60min)以及不同外源DNA浓度(5ng/μL,10ng/μL,25ng/μL和50ng/μL)对ICSI-Tr转基因效率的影响。结果显示:NaOH处理组的囊胚EGFP表达率(46.1%),与冻融精子处理组(47.1%)差异不显著,但发育率显著高于冻融处理精子组(28.3%vs16.7%,P<0.05)。处理60min组和30min组的分裂率分别为78.9%和77.5%,显著高于20min、10min和5min组的64.0%、60.0%和64.0%(P<0.05),其中30min处理组的囊胚EGFP表达率高达44.4%,显著高于其它处理组(P<0.05)。25ng/μL组和50ng/μL组的早期胚胎EGFP表达效率差异不显著(41.3%vs42.5%),但显著高于5ng/μL组和10ng/μL组(22.5%和35.5%),25ng/μL组的囊胚EGFP表达效率显著高于其它组(P<0.05)。本研究优化了应用ICSI-Tr生产转基因水牛胚胎技术体系,为获得ICSI-Tr转基因水牛奠定了良好的工作基础。
- 刘庆友王丹张会娜陈自洪孟凡丽陆凤花石德顺
- 关键词：水牛
