吉林省科技发展计划基金(20130206023NY)
- 作品数：9 被引量：32H指数：3
- 相关作者：李建华宫鹏涛张西臣张壮志杨升更多>>
- 相关机构：吉林大学天津农学院新疆畜牧科学院更多>>
- 发文基金：吉林省科技发展计划基金公益性行业(农业)科研专项国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学更多>>
- 猪弓形虫感染免疫胶体金试纸条的制备与初步应用被引量：13
- 2018年
- 制备1种检测猪弓形虫血清循环抗原的免疫胶体金试纸条。利用柠檬酸三钠还原法制备40nm的胶体金溶液，标记抗弓形虫表面抗原sAG3（surfaceantigen3，sAG3）单克隆抗体（Anti-A—SAG3—7），用另1株抗弓形虫表面抗原sAG3单克隆抗体（Anti—A—SAG3—23）与羊抗小鼠IgG抗体分别包被于硝酸纤维素膜（NC膜）上的检测线和质控线，制备并优化免疫胶体金试纸条检测条件。胶体金溶液的最适pH值为加入4uL 0．2mol／L K2CO3时的pH值。Anti—A-SAG3—7的最适标记量为12ug。最佳NC膜为Miltipore 135。T、C线抗体最佳包被质量浓度均为0．25g／L，T、C线抗体最佳包被体积均为8uL。试纸条的灵敏度达1：160，与猪囊虫阳性血清无交叉反应。稳定性试验表明，该试纸条置于室温至少可保存1个月有效，置于4℃可保存3个月有效。对广东某地区、吉林某地区猪场的各94份猪待检血清进行检测，分别有17，10份为阳性血清，样品阳性率为18．08％，10．63％。本研究制备的胶体金试纸条具有操作简单，敏感特异等优点，适合临床基层单位对猪弓形虫病的早期诊断及流行病学调查。
- 寇金华杨正涛刘维建高珺珊李建华杨举张西臣宫鹏涛
- 关键词：刚地弓形虫循环抗原胶体金
- 犬细粒棘球绦虫感染胶体金检测试纸条的制备被引量：3
- 2018年
- 目的制备犬细粒棘球绦虫感染胶体金检测试纸条。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,用于标记抗细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体2D12制作金标垫,兔抗细粒棘球绦虫Ediag A864多克隆抗体标记检测线(T线),羊抗鼠Ig标记质控线(C线),制备胶体金试纸条,并进行特异性、敏感性、重复性及稳定性试验。用优化的胶体金检测试纸条对96份犬粪样品(36份参照阳性样,60份临床样品)进行检测。结果制备的犬细粒棘球绦虫感染胶体金检测试纸条与犬蛔虫阳性粪及犬贾第虫阳性粪样品均无交叉反应;粪便稀释度为1∶4时仍可检出正确结果;3次检测参照阳性样本均为阳性;于不同温度(室温、4及37℃)下保存不同时间(1、2、3、4个月)的试纸条均可检出正确结果。96份犬粪便样品中,36份参照阳性样品检出率为97.2%(35/36),60份临床样品均为阴性。结论制备的试纸条具有良好的特异性及稳定性,可应用于临床样品检测及大规模流行病学调查。
- 高珺珊张西臣刘原源寇金华张壮志李建华杨举李赫李棕松宫鹏涛
- 关键词：细粒棘球绦虫胶体金试纸条
- 检测犬弓形虫感染双抗体夹心ELISA方法的建立被引量：2
- 2018年
- 目的用42#抗弓形虫SAG3单抗为捕获抗体、29#抗弓形虫SAG3单抗作为检测抗体建立检测犬弓形虫感染的双抗体夹心ELISA方法。方法利用HRP标记检测29#抗弓形虫SAG3单抗;采用棋盘滴定法确定捕获抗体42#抗弓形虫SAG3单抗的包被浓度和弓形虫阳性血清稀释度;对封闭剂、检测抗体的工作浓度等条件进行优化,并进行敏感性、特异性、重复性以及稳定性测定。用所建立的双抗体夹心ELISA方法对76份犬待检血清进行检测,计算阳性率。结果最佳优化条件为捕获抗体包被浓度为1∶800稀释(0.34μg/孔),弓形虫阳性血清稀释度为1∶12,封闭剂为10%FBS溶液,最佳封闭时间为2h,参考阳性血清最佳作用时间为2h,检测抗体稀释度1∶3 000,TMB底物最佳显色时间为10min。优化的ELISA敏感性为1∶48;与犬心丝虫阳性血清、犬等孢球虫阳性血清、犬蛔虫阳性血清及犬巴贝斯虫阳性血清之间均无交叉反应;批内、批间重复性试验的CV均<15%;保存于4℃中的包被板稳定性>90d。用该方法检测76份犬血清中的弓形虫抗原,阳性率为5.26%。结论建立的双抗体夹心ELISA方法特异、敏感,重复性好,可用于犬弓形虫感染的早期检测。
- 宋慧琦杨升袁枫张勇宫鹏涛李建华张西臣
- 关键词：刚地弓形虫双抗体夹心ELISA
- 弓形虫Rhomboid-IL-2基因重组卡介苗的构建及其对犬的免疫效果被引量：4
- 2016年
- 目的构建弓形虫Rhomboid以及犬白介素2基因重组卡介苗,并观察其对免疫犬的免疫效果。方法将鉴定正确的弓形虫Rhombiod基因和犬IL-2基因一起克隆到大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体和整合表达载体中,构建重组质粒pMV261(361)-IL2-Rho。将重组质粒转入卡介苗中,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析及Western blot鉴定。分别用重组卡介苗pMV261(361)-IL2-Rho和pMV261(361)-Rho经皮下免疫犬,检测免疫犬体液及细胞免疫水平变化并观察其存活时间。结果成功构建pMV261(361)-IL2-Rho重组质粒,弓形虫Rhomboid基因在重组卡介苗中稳定表达46ku的目的蛋白,Western blot显示该蛋白能被弓形虫感染鼠血清识别。动物实验表明,rBCGpMV261(361)-IL2-Rho能诱导产生较强的体液免疫和Th1型细胞免疫应答反应,rBCGpMV361-IL2-Rho免疫组感染弓形虫后的存活时间组为(14.40±4.50)d,rBCGpMV261-IL2-Rho免疫组感染弓形虫后的存活时间组为(13.00±4.75)d,较BCG对照组存活时间(8.20±5.45)d有所延长。结论 rBCGpMV261(361)-IL2-Rho蛋白具有免疫原性。该重组卡介苗对犬弓形虫感染有一定保护效果。
- 罗文武宫鹏涛李建华杨举李赫张西臣
- 关键词：弓形虫白介素2
- 犬细粒棘球绦虫感染Dot-ELISA检测方法的建立
- 本研究通过对抗细粒棘球绦虫EdiagA 864兔多克隆抗体进行HRP标记制备酶标抗体,抗细粒棘球绦虫Ediag A864单克隆抗体2D12作为包被抗体,建立犬细粒棘球绦虫感染Dot-ELISA检测方法,并进行特异性、敏感...
- 高珺珊张西臣刘原源寇金华张壮志李建华杨举李赫李棕松宫鹏涛
- 关键词：细粒棘球绦虫DOT-ELISA
- 文献传递
- 犬细粒棘球绦虫感染Dot-ELISA检测方法的建立被引量：1
- 2018年
- 为了建立犬细粒棘球绦虫感染Dot-ELISA检测方法,试验利用抗细粒棘球绦虫EdiagA864兔多克隆抗体进行HRP标记制备酶标抗体,以抗细粒棘球绦虫EdiagA864单克隆抗体2D12作为包被抗体,建立犬细粒棘球绦虫感染Dot-ELISA检测方法,对特异性、敏感性、重复性等进行研究,并用优化的Dot-ELISA检测方法对69份犬粪便样品进行检测。结果表明：所建立的Dot-ELISA检测方法敏感性为1∶8,与犬蛔虫阳性粪便、犬贾第虫阳性粪便均无交叉反应,使用不同批次的膜片均能得到相同结果;应用所建立的Dot-ELISA检测方法对69份犬粪便样品进行检测,其中9份人工感染参照样品的检出率为100%（9/9）,60份长春地区临床样品检测结果为阴性。说明试验建立的犬细粒棘球绦虫感染Dot-ELISA检测方法具有较高的特异性和敏感性,可用于犬细粒棘球绦虫感染的临床检测。
- 高珺珊张西臣刘原源寇金华张壮志李建华杨举李赫李棕松宫鹏涛
- 关键词：细粒棘球绦虫多克隆抗体单克隆抗体DOT-ELISA
- 猪弓形虫重组卡介苗的构建及其免疫保护性被引量：3
- 2018年
- 目的构建弓形虫Rhomboid基因和猪IL-2基因的重组卡介苗(BCG),并分析其免疫保护效果。方法应用RT-PCR技术分别扩增弓形虫Rhomboid基因和猪IL-2基因,克隆至p MD18-T载体中,双酶切鉴定及测序正确后,将弓形虫Rhomboid基因和猪IL-2基因串联后分别连接至穿梭表达载体pMV261和整合表达载体pMV361中,电转化BCG,制备重组BCG pMV261-IL-2-Rho和pMV361-IL-2-Rho。分别经颈部肌肉注射免疫猪,共3次,每次间隔2周,免疫剂量均为108 CFU/只,采用ELISA法检测免疫前后猪体内抗体(IgG)滴度、Th1型及Th2型细胞因子的变化情况;第3次免疫后2周通过腹腔注射的方式接种弓形虫China I株速殖子1×108个/只进行攻虫试验,观察重组BCG对猪的免疫保护效果。结果成功构建了重组BCG p MV261-IL-2-Rho和p MV361-IL-2-Rho。重组BCG免疫猪后,随着免疫次数的增加,血清中抗体滴度也逐渐升高,且与PBS对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。3次免疫后,pMV261-IL-2-Rho组血清Th1型细胞因子IL-2、IFNγ和IL-12的表达水平均明显提高,与PBS对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),而pMV361-IL-2-Rho组血清IL-2、IFNγ和IL-12的水平虽略有升高,但与PBS对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05);各组在免疫过程中Th2型细胞因子IL-4水平均未发生明显变化。攻虫后各组猪出现精神沉郁,食欲下降,体温升高等症状,耐过发病期后的猪,食欲逐渐恢复,体温渐趋正常,各种症状减轻,且各组猪在攻虫后20 d均无死亡。结论构建的基因重组BCG pMV261-IL-2-Rho对猪弓形虫感染具有一定的免疫保护作用。
- 于艳辉杨升姜鑫信彩岩李显赫王伟荣李建华张西臣宫鹏涛
- 关键词：弓形虫IL-2基因重组卡介苗免疫保护
- 猪弓形虫循环抗原双抗体夹心ELISA检测方法的建立及应用被引量：2
- 2018年
- 目的建立一种检测猪血清中弓形虫循环抗原(circulating antigen,CAg)的双抗体夹心ELISA法。方法利用抗弓形虫表面抗原3(surface antigen 3,SAG3)的单克隆抗体Anti-A-SAG3-7作为捕获抗体,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗弓形虫SAG3的单克隆抗体Anti-A-SAG3-23作为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA法,并对方法的捕获抗体(1∶400~1∶6 400倍比稀释)、检测抗体(1∶400~1∶12 800倍比稀释)、血清稀释度(1∶10~1∶80倍比稀释)及封闭液的种类(5%脱脂奶粉、10%胎牛血清、5%BSA、1%BSA)进行优化,同时验证该方法的敏感性、特异性及精密性。采用优化后的方法对广东和吉林地区的各94份猪血清样本进行检测。结果双抗体夹心ELISA法的最佳检测条件为:捕获抗体Anti-A-SAG3-7及检测抗体HRP-Anti-A-SAG3-23稀释度均为1∶3 200,封闭液为1%BSA,血清稀释度为1∶80。该方法检测两份猪囊虫阳性血清无交叉反应,灵敏度达1∶640,批内及批间的变异系数(CV)均<11%。广东和吉林地区各94份样品的阳性率分别为20.2%(19/94)和11.7%(11/94)。结论该方法具有良好的特异性、敏感性及精密性,可用于猪弓形虫CAg的检测。
- 寇金华杨正涛刘维建高珺珊李建华张西臣宫鹏涛
- 关键词：弓形虫循环抗原表面抗原双抗体夹心ELISA
- 斯氏艾美耳球虫Rhomboid基因抗原优势区的筛选与鉴定被引量：3
- 2017年
- 为了筛选并鉴定斯氏艾美耳球虫Rhomboid基因抗原优势区,试验采用预测斯氏艾美耳球虫Rhomboid基因跨膜结构域,PCR扩增4段目的片段,构建表达载体,并通过SDS-PAGE和Westernblot技术分析目的蛋白。结果表明:成功克隆出4段斯氏艾美耳球虫Rhomboid基因,片段大小分别为102 bp、75 bp、93 bp、99 bp,重组原核表达质粒p ET-32a-Rho1~4构建成功;经SDS-PAGE和Western-blot分析,构建的4段重组质粒都得到了表达且与理论值相符,且重组蛋白中p ET-32aRho4可与兔斯氏艾美耳球虫阳性血清发生特异性反应。
- 田依凡赵权信彩岩董井泉宫鹏涛李建华张西臣
- 关键词：斯氏艾美耳球虫原核表达
- 检测犬弓形虫SAG3抗体间接ELISA方法的建立被引量：5
- 2016年
- 目的以弓形虫重组SAG3蛋白为抗原,建立一种检测犬弓形虫抗体的间接ELISA方法。方法采用棋盘滴定法确定抗原的包被浓度和阳性血清稀释度,再对该方法的封闭剂以及封闭时间、犬弓形虫阳性血清孵育时间、二抗稀释度以及加入显色液孵育时间等各项条件进行优化;通过对弓形虫感染犬血清及犬心丝虫、等孢球虫、蛔虫及巴贝斯虫感染血清的检测评价方法的敏感性和特异性。结果该方法最佳优化条件分别为:抗原包被浓度0.82μg/孔,封闭剂为含10%胎牛血清的PBST,被检血清稀释度1∶20;兔抗犬酶标二抗稀释度1∶8 000。优化的ELISA敏感性为1∶1 280,犬心丝虫、等孢球虫、蛔虫及巴贝斯虫感染血清均未发生交叉阳性反应;批间、批内重复性试验的变异系数均<15%。结论建立的ELISA方法特异性较强,敏感性高,批内、批间重复性较好,可用于犬弓形虫感染的检测。
- 宋慧琦杨升高珺珊宫鹏涛李建华张西臣
- 关键词：弓形虫抗体间接ELISA
