国家重点基础研究发展计划(2008CB117017)
- 作品数：11 被引量：63H指数：4
- 相关作者：钟发刚黄新韩猛立薄新文王新华更多>>
- 相关机构：新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室石河子大学新疆农垦科学院更多>>
- 发文基金：国家重点基础研究发展计划国家自然科学基金兵团博士基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 牛病毒腹泻病毒(BVDV)E2重组蛋白ELISA检测方法的初步建立被引量：4
- 2010年
- 【目的】为牛病毒性腹泻病毒抗体快速检测提供敏感、特异检测方法。【方法】重组质粒pET-(1-345)转化宿主菌BL21(DE),以IPTG进行诱导表达,使外源基因获得了较高水平的表达;Westem一blot检测表达产物反应原性,同时进行特异性检测;将收集的纯培养物进行超声波裂解后以His bind kit蛋白质纯化试剂盒纯化回收目的蛋白,再以纯化后的目的蛋白作为包被抗原进行方阵滴定试验,确定目的蛋白作为包被抗原的最佳稀释度。【结果】重组蛋白表达可达菌体蛋白总量的19.7%,且具有较好的反应原性和特异性,以此方法建立的间接ELISA方法对收集的约43头份血清样品进行检测,检测阳性结果与进口试剂盒检测结果符合率达到93.55%。【结论】以BVDV E2重组蛋白作为抗原建立的间接ELISA检测方法是可行的,为其进一步的标准化莫定基础。
- 钟发刚黄新王新华李娜
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒ELISA
- 犊牛肺炎的诊断观察
- 2015年
- 牛病毒性腹泻病（Bovine viral diarrhea,BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的,主要特征为黏膜发炎、糜烂、坏死和腹泻等症状.国内自李佑民等[1] （1984）首次分离到毒株以来,已有十几个省市地区的畜群存在BVDV的感染[2-4].钟发刚等[5-6]研究结果表明,BVDV感染在新疆大部分地区广泛存在,但大多为BVDVlb亚型和BVDVlc亚型.牛支原体主要引起牛的肺炎、关节炎、乳房炎等[7].该病的存在与流行能够给养牛业带来较大的经济损失[8-10].国内辛九庆等（2008）首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到的,后来已经从多个省市有报道[11-13].
- 黄新马辉韩猛立何延华钟发刚
- 关键词：牛肺炎牛病毒性腹泻病毒BVDVC亚型支原体
- 牛病毒性腹泻病毒感染牛外周血单核细胞对CD80和CD86 mRNA转录的影响被引量：1
- 2012年
- 用非致细胞病变(noncytopathic,NCP)和致细胞病变(cytopathic,CP)型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染临床健康BVDV检测阴性的荷斯坦奶牛外周血单核细胞(PBMC),利用实时荧光定量PCR技术对感染后共刺激分子CD80和CD86mRNA转录水平的变化进行定量分析。结果表明,在NCP型BVDV感染牛PBMC后CD80在4h(P<0.05)和12,24h(P<0.01)出现2次转录高峰,CD86在6h(P<0.05)出现转录高峰;CP型BVDV感染后,CD80在24h(P<0.05)出现转录高峰,CD86在6h(P<0.05)出现转录高峰。尽管CD80在NCP型BVDV感染后呈现较复杂的动态变化,但结果提示NCP型和CP型BVDV感染均可导致牛PBMC的共刺激分子CD80和CD86基因转录在感染早期明显受到抑制,PBMC的抗原呈递能力受到影响。
- 韩猛立黄新钟发刚
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒外周血单核细胞CD80CD86
- 牛IFN-α、IFN-β及IFN-γ mRNA实时SYBR GreenⅠ定量RT-PCR检测方法的建立及应用被引量：4
- 2010年
- 为建立灵敏度高、特异性强、能够快速检测牛α-、β-、γ-干扰素(BoIFN-α、BoIFN-β、BoIFN-γ)mRNA的实时荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中登录的BoIFN-α、BoIFN-β和BoIFN-γ基因序列,分别在其保守区内设计并合成特异引物,以牛3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)mRNA为内参,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。将BoIFN-α、BoIFN-β和BoIFN-γcDNA分别克隆到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌DH5α内,经PCR及测序鉴定,将得到的阳性重组质粒制备成标准品,建立SYBR Green荧光定量PCR标准曲线并分析溶解曲线,进行灵敏性、特异性和重复性试验。结果表明:BoIFN-α、BoIFN-β、BoIFN-γ和GAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1×101copies/μL～1×107copies/μL内均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.991。熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,特异性和重复性较好。本研究建立的检测牛IFN-α、IFN-β和IFN-γmRNA的实时荧光定量PCR方法,为牛IFN mRNA水平上的定量分析奠定了基础。
- 韩猛立杨井泉姚守秀黄新薄新文钟发刚
- 关键词：SYBRΒ-干扰素
- 牛病毒性腹泻病毒与宿主细胞的相互作用研究被引量：4
- 2012年
- 自1946年Olafson等首次在美国纽约州发现牛病毒性腹泻病毒(BVDV)以来,该病毒在世界各地广泛流行和传播,尤其对一些畜牧业发达国家的奶业和牛肉业造成了巨大损失。了解牛病毒性腹泻病的致病机理,研制出更加安全可靠有效的疫苗,对控制该病的发生和蔓延尤为重要。对BVDV的病原学、生物学特性以及对宿主细胞的相互作用等进行了阐述,以期为BVDV的预防及治疗奠定基础。
- 韩猛立黄新宋天增杨井泉薄新文钟发刚
- 关键词：分子生物学细胞生物学宿主细胞
- 牛病毒性腹泻病毒感染牛外周血单核细胞对IFN-α、β、γmRNA转录的影响被引量：1
- 2012年
- 为了解牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染对干扰素(IFN)mRNA转录时相的影响,探讨宿主-病毒之间的相互关系,用非致细胞病变(noncytopathic,NCP)和致细胞病变(cytopathic,CP)型BVDV感染临床健康BVDV检测阴性的荷斯坦奶牛外周血单核细胞(PBMC),利用实时荧光定量PCR技术对感染后IFN-α、β、γmRNA转录水平的变化进行定量分析。结果表明,CP型和NCP型BVDV感染PBMC后,Ⅰ型IFN(IFN-α、β)均呈现出不同程度的转录水平上调,且差异极显著(P<0.01);只有IFN-α在CP型BVDV感染后4,12h(P<0.5)出现转录下调。IFN-γ在整个感染过程中均呈现出不同程度的转录水平上调,且差异显著(P<0.05)。这表明2种生物型BVDV感染可引起PBMC中IFN mRNA转录水平升高。
- 韩猛立黄新钟发刚
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒外周血单核细胞实时荧光定量PCR
- 新疆石河子地区牛病毒性腹泻病毒的分子流行病学调查被引量：21
- 2009年
- 根据GenBank中公布的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5'UTR保守区基因序列,设计3对引物,应用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法对采自石河子地区3个场的64份牛全血样品进行核酸检测及测序。结果表明:BVDV阳性率为39.06%(25/64),其中有22对母子对应样品,母牛阳性率为40.91%,犊牛为45.45%,提示新疆石河子地区BVDV垂直感染较严重。9头牛表现临床症状,阳性率为22%,其余为临床健康牛,阳性率为41.81%,数据显示新疆石河子地区奶牛BVDV隐性感染严重。测序得到2条不同的序列,经5'UTR区域核酸序列同源性比较和系统发生分析表明2株病毒与VEDEVAC(匈牙利弱毒疫苗株)亲缘关系最近,同源性达96.2%～100%,用DNASTAR软件进行基因与系统发生进化关系分析属于BVDV-1b基因亚型,未检测到BVDV-2型病毒。提示新疆石河子地区BVDV流行株为BVDV-1b亚型,且经生物型鉴定,所测阳性样品为非致细胞病变型。本研究可为今后的流行病学研究和疫苗应用等防制措施提供依据。
- 李娜韩猛立黄新薄新文王新华赵玉龙钟发刚
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒分子流行病学
- 牛Th1/Th2型细胞因子实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用被引量：2
- 2011年
- 根据GenBank中牛Th1/Th2(BoTNF-α、BoIFN-γ、BoIL-2、BoIL-4、BoIL-6、BoIL-8、BoIL-10)型细胞因子的基因序列,在保守区设计并合成各自特异引物,并以牛3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)基因为内参,采用SYBR GreenⅠ染料以建立实时荧光定量PCR检测方法。将Th1/Th2型细胞因子基因克隆至pMD18-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR-GreenⅠ荧光定量RT-PCR标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性、特异性和重复性试验。对建立的Th1/Th2型细胞因子SYBR-GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法进行分析,结果表明牛IFN-α、IFN-β、IFN-γ和GAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1×101～1×108 copies/μL范围分别呈良好的线性关系,相关系数均大于0.991。溶解曲线分析表明产物为特异的单峰,具有较高的灵敏性和特异性,重复性较好。建立了检测Th1/Th2型细胞因子的实时荧光定量RT-PCR方法,为在mR-NA水平对牛Th1/Th2型细胞因子的定量分析奠定了基础。
- 韩猛立蔡曰鹏黄新何延华薄新文钟发刚
- 关键词：TH1/TH2型细胞因子外周血单个核细胞实时荧光定量RT-PCRSYBR
- 牛病毒性腹泻病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用被引量：6
- 2010年
- 参照多株不同基因型和基因亚型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′UTR相对保守的基因序列,设计3对引物,其中1对能够扩增不同基因型BVDV 5′UTR片段(288 bp),另2对分别能够扩增BVDV-1型和BVDV-2型5′UTR片段(195 bp和116 bp)。扩增片段大小与预计片段一致。对PCR反应条件进行优化,建立了一种特异、敏感的RT-nPCR检测方法。敏感性试验表明,敏感性为10-2TCID50/mL。特异性试验表明,对猪瘟兔化弱毒疫苗株、牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒的检测结果均为阴性。通过对新疆部分地区无BVD临床症状的牛场208份奶牛血样检测,阳性率为50.43%,表明该方法具有快速、简便、特异性强和灵敏度高等特点,可以作为BVDV隐性感染临床诊断的有效方法。
- 韩猛立李娜黄新薄新文王新华赵玉龙钟发刚
- 关键词：牛病毒性腹泻病毒
- 牛病毒性腹泻病流行现状与防制被引量：11
- 2010年
- 牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒引起的多种动物感染的一类重要传染病,给世界畜牧业尤其是养牛业以及相关产业造成巨大的经济损失。本文主要阐述了牛病毒性腹泻的国内外流行现状、发展趋势以及防治概况,以期为我国防治该病提供一些借鉴和参考。
- 韩猛立黄新钟发刚薄新文
- 关键词：牛病毒性腹泻防制
