国家高技术研究发展计划(2012AA021500)
- 作品数：5 被引量：10H指数：2
- 相关作者：邓辉韦传宝陈晟吴敬陈坚更多>>
- 相关机构：皖西学院江南大学更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划中央高校基本科研业务费专项资金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程更多>>
- T26P和A30P位点突变对Thermobifida fusca葡萄糖异构酶热稳定性及活性的影响被引量：2
- 2013年
- 通过定点突变技术构建了嗜热菌Thermobifida fusca葡萄糖异构酶(TFGI)的3个突变体:TFGI/T26P,TFGI/A30P和TFGI/T26P/A30P。结果表明突变体TFGI/A30P的热稳定性得到提高,70℃下半衰期从14.9h提高到22.3h,且最适温度不变,最适温度下的比酶活保持不变。而突变体TFGI/T26P和TFGI/T26P/A30P在70℃下半衰期都降到8.1h,最适温度和最适温度下的比酶活也都显著降低。TFGI及其单突变体的三维结构模型叠加分析结果表明:突变体A30P没有产生其它分子间作用力,TFGI的"Phe27环"的基本结构没有改变,因脯氨酸残基降低了蛋白解折叠的熵值,所以其热稳定性提高而比活力不变。
- 邓辉陈晟陈坚吴敬
- 关键词：定点突变热稳定性嗜热菌葡萄糖异构酶
- 大肠杆菌磷酸甘油酸脱氢酶突变体的构建及抗反馈抑制效应被引量：1
- 2016年
- 磷酸甘油酸脱氢酶(D-3-phosphoglycerate dehydrogenase,PGDH,EC 1.1.1.95)为L-丝氨酸合成途径的关键酶,其编码基因为ser A,其活性受到合成产物L-丝氨酸的反馈抑制调控。为解除丝氨酸的反馈抑制,采用定点突变技术把编码PGDH酶344位组氨酸或346位天冬氨酸或364位天冬氨酸的密码子定点突变为丙氨酸密码子。改造后的ser AFbr被连到表达载体pT7-7上,并转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达,破壁回收粗酶液,通过DEAE阴离子柱纯化PGDH突变体,并对其酶活性和IC_(50)值进行了测定。结果,野生型PGDH酶IC_(50)值为7μmol/L,而PGDH双突变体N346A/H344A催化活性与野生型相近,在丝氨酸浓度为160 mmol/L时,其酶活仍保持未添加丝氨酸时酶活的96%,基本解除反馈抑制。
- 邓辉陈存武孙传伯韦传宝
- 产葡萄糖异构酶细胞的固定化被引量：5
- 2013年
- 采用壳聚糖絮凝和戊二醛交联的方法,对表达生产Thermobifida fusca葡萄糖异构酶(GIase)的重组大肠杆菌细胞进行固定化工艺研究,以期获得高性能和低成本的固定化产酶细胞方法。考察影响细胞絮凝和交联的各种因素,并对固定化酶制剂的理化性质、动力学常数进行测定。结果表明:最佳的固定化条件为在高密度发酵液中添加0.6%硅藻土和5mmol/L Mg2+,经60℃热处理30min后,在壳聚糖终质量分数0.1‰、pH5.5、充分搅拌条件下絮凝,酶活回收率达98%;絮凝产物在戊二醛体积分数0.25%、pH6.5、轻微搅拌条件下交联3h,以未交联的样品作参照(100%),交联样品的酶活保留率达80%。相对于游离GIase,此条件下制备的固定化GIase的最适温度仍为80℃、最适pH值从10降低至9;在工业生产应用条件下,固定化GIase的初始酶活力达到356U/g,半衰期为61d,能够满足高果糖浆工业的生产要求。
- 邓辉陈晟陈坚吴敬
- 关键词：葡萄糖异构酶固定化
- 构建融合蛋白提高重组葡萄糖异构酶的催化性能被引量：2
- 2016年
- 为研究Ⅱ型Xylose/Glucose的N端蛋白序列对I型Xylose/Glucose的作用,实验将源自超嗜热菌Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus的Ⅱ型葡萄糖异构酶(TTGIase)N端31个氨基酸序列融合到嗜热菌Thermobifida fusca的Ⅰ型葡萄糖异构酶(TFGIase)的N端,构建了融合蛋白N-TFGIase。实验结果显示:在相同培养和诱导条件下,N-TFGIase,菌体单位浓度产酶量比TFGIase高出约40%,比酶活比TFGIase高出26%,最适温度比TFGIase高出5℃,75℃下的半衰期较TFGIase延长30%,最适pH较TFGIase降低1.0。序列分析表明:TTGIase N端序列的mRNA二级结构不形成有阻碍的颈环结构,提高了融合蛋白的表达效率;其含有的31个氨基酸残基的疏水性指数均小于0,利于融合蛋白的初始折叠和包装;其含有的酸性氨基酸残基比例约为碱性氨基酸残基比例的两倍,减小了酸性介质环境对融合蛋白分子表面的影响。
- 邓辉王广林陈乃东韦传宝
- 关键词：融合蛋白
- Thermobifida fusca葡萄糖异构酶在枯草杆菌中的表达被引量：2
- 2015年
- 为研究葡萄糖异构酶(GIase)在枯草杆菌中的表达效果,通过PCR扩增Thermobifida fusca GIase基因xyl A,分别克隆该基因序列到不同诱导表达方式的穿梭载体:p HCMC04、p MA09、p AL12,并转化枯草杆菌WB600。结果表明,含重组质粒p MA09-xyl A的枯草杆菌产酶最优,达到1.8 U/m L。对该重组枯草杆菌发酵产酶条件进行优化,以TB为发酵培养基,初始p H 7.0,温度为30℃时,摇瓶培养24 h后,GIase的产量达到5.6 U/m L。
- 邓辉陈存武孙传伯韦传宝
- 关键词：枯草芽孢杆菌发酵优化
