国家重点实验室开放基金(2008-2009)
- 作品数：6 被引量：17H指数：3
- 相关作者：吴润赵春林王川李发弟王芳更多>>
- 相关机构：甘肃农业大学中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃中医药大学更多>>
- 发文基金：国家重点实验室开放基金国家教育部博士点基金甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- 马麝朊蛋白基因的克隆与原核表达被引量：1
- 2009年
- 为了解马麝朊蛋白基因的结构特征和其细胞型朊蛋白的性质,应用分子克隆和DNA重组技术进行了马麝朊蛋白基因的克隆、序列分析及其原核表达。序列分析表明,马麝朊蛋白基因编码区是包含在单一外显子内的完整开放阅读框,全长为771 bp,与马鹿、白尾鹿以及乳牛和绵羊朊蛋白基因相比,核苷酸序列和推导氨基酸序列的同源性分别为97.3%-98.1%和97.7%-98.8%,说明朊蛋白基因在同科和不同科的反刍动物间是保守的 成功构建了马麝重组朊蛋白（85-233 aa）原核表达载体pGEX-MuPrP（85-233）,并转化E.coliBL21（DE3）,获得重组表达菌E.coliGST-MuPrP（85-233）,该重组菌可产生预期大小约为42.4ku的融合蛋白GST-MuPrP（85-233）,在优化表达条件下,可产生占细菌总蛋白量30%以上的融合蛋白,免疫印迹检测显示表达蛋白可与抗牛单克隆抗体4C11反应,表明该基因的各氨基酸突变并未影响其单抗4C11的识别表位。
- 王辉太吴润张小丽姜中毅陈豪泰
- 关键词：马麝朊蛋白基因克隆原核表达
- 绵羊PRNP等位基因PCR-SSCP分析条件的优化被引量：4
- 2008年
- 为进行绵羊PRNP等位基因密码子136、154、171的多态性研究,建立适合于绵羊PRNP等位基因开放阅读框(ORF)内高变区PCR-SSCP分析方法,对凝胶浓度、交联度、甘油浓度、电泳电压、电泳时间、PCR产物与变性缓冲液比例、电泳缓冲液浓度、上样量等影响因素进行了优化试验。在优化中引入了正交试验法,以使优化过程简化,结果可靠。结果表明,交联度49∶1、甘油浓度0%、凝胶浓度12%、电泳电压200 V、PCR产物上样量≥2.0μL且<4.0μL、PCR产物与变性缓冲液比例1∶4、0.5×TBE缓冲液及4℃电泳45 h为最佳试验条件,据此建立了绵羊PRNP等位基因136、154、171密码子的PCR-SSCP分析方法。
- 赵春林王川吴润李发弟柳纪省
- 关键词：绵羊正交试验
- 分子信标实时荧光定量PCR构绵羊PrP基因质粒和标准曲线被引量：6
- 2011年
- 目的为能够用实时荧光定量PCR研究消化系统PrP mRNA的表达水平,构建目的基因PrP的标准品质粒和标准曲线。方法根据GenBank中绵羊基因编码区保守序列,设计特异性引物和分子信标探针;提取总RNA,经反转录、RT-PCR后,提取质粒,PCR-SSCP及测序鉴定,获得ARQ质粒;将质粒梯度稀释,进行荧光定量PCR,获得标准曲线及回归方程。结果结果显示,本实验设计的分子信标具有特异性强、灵敏度高和结果准确的特性;标准曲线相关系数r2=0.999,表明线性关系好,成功构建了目的基因的标准品质粒和标准曲线。
- 王川吴润李发弟刁小龙赵春林王芳
- 关键词：PRPRT-PCR实时荧光定量PCR质粒绵羊
- 小尾寒羊PRNP等位基因密码子136、154和171的多态性研究被引量：1
- 2010年
- 为研究小尾寒羊PRNP等位基因密码子多态性,本研究以绵羊全血基因组DNA为模版,通过PCR,扩增绵羊PRNP等位基因目的片段,并将其克隆于pMD-18T载体。经SSCP法筛选出阳性克隆后测序,确定各绵羊PRNP136位、154位和171位密码子等位基因型及频率分布。在104只绵羊中共检出15个PRNP136位、154位和171位密码子等位基因型,痒病易感基因型占优势(53.85%,56/104)。本研究证明,该绵羊群属于痒病易感/易发群体,一旦痒病传入具有罹患痒病的极大可能性。
- 赵春林吴润李发弟柳纪省王川王芳
- 关键词：绵羊多态性PCR-SSCP
- 黄牛朊蛋白原核表达产物的复性与活性分析被引量：1
- 2010年
- 目的复性黄牛朊蛋白原核表达产物,分析复性蛋白的活性,以获得有活性的牛重组朊蛋白。方法构建并诱导表达黄牛朊蛋白基因重组菌,复性其包涵体裂解物,对GST-BoPrP(93～241)(Q234R)复性产物进行GSTrap FF柱层析纯化,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹观察其提纯和复性效果。结果重组菌可表达分子质量约为42.4 ku的目的蛋白,包涵体裂解物经过透析复性后,可获得较高纯度的复性目的蛋白。各复性产物和纯化的GST-BoPrP(93～241)(Q234R)蛋白经免疫印迹鉴定,发现仅分子质量约为42.4 ku的条带与单抗4C11结合。结论获得高纯度复性黄牛朊蛋白原核表达蛋白,具有良好的免疫反应活性。
- 呼志斌吴润刘湘涛陈建华赵春林
- 关键词：原核表达复性活性分析
- 绵羊PRNP密码子136和154及171等位基因型的ARMS-PCR鉴定方法的建立被引量：4
- 2013年
- 根据已获得的绵羊PRNP密码子136、154和171等位基因型的序列,设计并合成了针对各等位基因型的特异性引物,摸索3′末端引入的错配碱基种类及位置,优化扩增条件,以建立绵羊PRNP密码子136、154和171等位基因型的ARMS-PCR鉴定方法。应用ARMS-PCR分析已知PRNP等位基因型的绵羊血样,验证ARMS-PCR与PCR-SSCP鉴定PRNP等位基因型的符合率。经ARMS-PCR验证,已知的15种绵羊PRNP等位基因型的94份血样,两者的基因分型符合率达100%。研究结果显示,该ARMS-PCR分型法能够准确鉴定出绵羊PRNP密码子136、154和171的等位基因型,且具有简便、快速、廉价的优点,适合于绵羊PRNP等位基因型的普查。
- 王芳赵春林吴润王川
- 关键词：绵羊
