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假单胞菌产弹性蛋白酶基因的克隆与表达: 2014年; 从假单胞菌(Pseudomonas sp.)XZG36中克隆弹性蛋白酶基因,构建原核表达载体,实现其在大肠杆菌(Escherichia coli)中的高效表达,并对表达产物进行酶学性质分析,为微生物发酵生产弹性蛋白酶奠定基础.以假单胞菌基因组DNA为模板,PCR扩增弹性蛋白酶基因,并将其开放阅读框(ORF)克隆至融合表达载体pET30a(+)进一步IPTG诱导表达;表达产物经His·Bind亲和层析纯化后对弹性蛋白酶进行酶学性质分析.实验成功克隆了弹性蛋白酶基因,DNA基因片段为1672bp、编码497个氨基酸残基的多肽,与预计长度相符合;实现了其在E.coli中的高效表达,表达量约占菌体总蛋白的20%;经SDS-PAGE分析,相对分子质量为48 000,与预期的一致;提纯后的表达蛋白SDS-PAGE分析可见单一条带,纯度可达92%以上.表达蛋白具有良好活性.; 高兆建王东星王红建苗倩钦; 关键词：弹性蛋白酶基因克隆

广谱拮抗菌株的筛选诱变及抗菌物质分离鉴定被引量：5: 2021年; 分离和鉴定产生广谱抗菌活性物质的菌株,并对抗菌物质分离鉴定。通过形态学、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定菌株。采用紫外线-硫酸二乙酯化学复合诱变的方法,获得抗菌能力强、遗传稳定的高产菌株。分别用甲醇提取、凝胶过滤色谱(Sephadex G-10)和半制备高效液相色谱分离纯化抗菌物质,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术对抗菌物质鉴定。本研究从土壤中分离出67株芽孢杆菌。其中8株表现出较强的抗菌作用,菌株XF32表现出显著广谱抑制活性,并鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。菌株XF32对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、铜绿假单胞菌7种病原菌具有抗菌活性,对酿酒酵母、黑曲霉、深绿木霉和尖孢镰刀菌有抗真菌活性。经诱变筛选得到突变菌株XF32-22,对金黄色葡萄球菌的抑菌活性比原始菌株显著提高,分离纯化抗菌物质,得到单一的抗菌成分。MALDI-TOF-MS分析表明抗菌物质为Fengycin系脂肽化合物。采用复合诱变技术,可以有效地提高地衣芽孢杆菌脂肽的产量。成功分离得到对多种病原细菌具有较强抑制作用的Fengycin类脂肽,同时该菌株在拮抗植物病原真菌方面也有明显效果。XF32-22菌株在食品保鲜和农业生物防治方面具有很好的应用前景。; 高兆建王秋芬丁飞鸿许祥赵宜峰焦魏陈腾; 关键词：地衣芽孢杆菌诱变脂肽

源自泡菜的植物乳杆菌产新型广谱抑菌细菌素的特性分析被引量：9: 2021年; 筛选对食源性致病菌和腐败菌有特异性抑制作用的产细菌素乳酸菌菌株,并研究细菌素的特性,为其在食品防腐中的应用提供参考。从分离自泡菜的112株乳酸菌中反复筛选得到1株产细菌素(BacH32)菌株(Hlh32),经鉴定菌株Hlh32为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),其在35℃MRS培养基中发酵至稳定期即18~24 h达到最大BacH32产量(对金黄色葡萄球菌的抑菌活性达到1 850 AU/mL)。通过硫酸铵盐析、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-15凝胶过滤层析、制备型高效液相色谱等方法进行纯化。Trinice十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示BacH32分子质量为6.7 kDa,与文献报道的植物乳杆菌细菌素分子质量有显著差异。细菌素BacH32对蛋白酶敏感,而脂肪酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶对其无影响,表明BacH32为蛋白质。BacH32在pH 2~9的环境下孵育4 h,在37、60、80、100℃保持30 min或121℃保持15 min仍能保持较好抑菌活性。细菌素BacH32对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有广谱抑菌活性,对真菌也有一定的抑菌活性。向培养至对数初期的金黄色葡萄球菌中添加BacH32,菌体生长完全受到抑制。以上特性表明植物乳杆菌Hlh32合成的细菌素BacH32有潜力作为天然食品防腐剂在食品中使用。; 高兆建黄亮浩丁飞鸿赵宜峰陈腾; 关键词：植物乳杆菌细菌素纯化抑菌作用

构巢曲霉产植酸酶的酶学特性分析被引量：1: 2020年; 从构巢曲霉AnP-16菌株发酵液中纯化单一组分的耐热耐酸植酸酶,并对酶学特性进行分析,为其在食品工业中的应用提供理论依据。通过硫酸铵盐析、离子交换层析和疏水层析纯化植酸酶,SDS-PAGE电泳测定其分子量。结果表明,从该菌株发酵液中纯化到了单一组分的植酸酶,纯化倍数60.8倍、回收率41.6%,酶分子量约52 kDa。植酸酶最适作用温度和pH分别为55℃和pH4.0,在pH3.0~6.0范围酶活性较高,pH2.0~7.0下孵育3 h,仍能保持80%以上活性。植酸酶耐热性好,70℃孵育1 h仍能保持81%活性。Hg^2+、Mn^2+、Fe^2+、Cu^2+和Zn^2+ 5 mmol/L浓度下对酶活性有明显抑制作用,但Ca^2+和Mg^2+在1和5 mmol/L浓度时均增强酶活性;有机溶剂甲醇和乙醇在2%浓度有激活作用;SDS抑制酶活性,但其它表面活性剂(Triton X-100和Tween 80)和有机溶剂(丙酮和异戊醇)对酶活性无明显影响。植酸酶有宽泛的底物特异性,但对植酸钠的催化活性最强,其K_m值为0.576 mmol/L。基于植酸酶耐酸耐热及宽广的底物催化活性,其有望应用于粮油食品加工领域,提高食品的营养价值。; 高兆建杨培玲杨芳宋玉林赵宜峰焦魏陈腾; 关键词：植酸酶构巢曲霉酶学性质

干酪乳杆菌细菌素的分离纯化及抑菌特性分析被引量：1: 2020年; 该文从干酪乳杆菌XbC-36发酵液中分离纯化细菌素(命名为BaC21)并分析抑菌特性,为开发为新型食品防腐剂奠定理论基础。硫酸铵盐析、Sephadex G-15柱层析和半制备高效液相色谱法纯化BaC21。三羟甲基氨基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,Tricine-SDS-PAGE)法测定细菌素分子质量。菌株XbC-36在MRS培养基中发酵稳定期前期(18 h)细菌素达到最大产量1695 AU/mL。BaC21分子质量4.4 kDa,与其他细菌素分子质量不同,推测为一种新型细菌素。BaC21在37~100℃加热30 min抑菌活性几乎无变化,120℃加热15 min抑菌活性下降,但没有完全丧失,表明具有较高热稳定性;BaC21在pH 2~8保持稳定;有机溶剂和表面活性剂对BaC21抗菌活性无影响,但SDS能提高其抗菌活性;经多种蛋白酶处理后,其抑菌活性完全失活,而脂肪酶和α-淀粉酶则无明显作用,表明BaC21具有蛋白质性质。BaC21具有广谱抑菌活性,尤其对革兰氏阴性食源性致病菌具有强抑制作用。BaC21能使金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)和大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)细胞裂解而发挥抑菌作用。BaC21优良的抑菌特性表明其有开发为食品生物防腐剂的潜力。; 高兆建曹珊珊宋玉林丁飞鸿赵宜峰焦魏; 关键词：干酪乳杆菌细菌素分离纯化抑菌特性

凝结芽孢杆菌XZQ-16抗菌脂肽分离鉴定及抗菌特性被引量：7: 2021年; 对凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)XZQ-16脂肽分离鉴定并探讨其抗腐败菌特性。通过酸沉、硅胶柱层析和Sephadex LH-20层析对脂肽分离纯化,利用傅里叶红外光谱(FT-IR)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)对脂肽分析鉴定。结果表明,硅胶柱层析得到三个流分具有明显抗菌活性;Sephadex LH-20层析分离出四个洗脱峰,洗脱峰III抑菌活性明显;FT-IR确定纯化的抗菌物质中含有脂肽类化合物;RP-HPLC分析并与标准样对照确定分离的抗菌物质为伊枯菌素(iturin)和表面活性素(surfactin)同系物。脂肽宽泛的pH范围(4.0~12.0)酸碱耐受性好,在120℃以下保温30 min抗菌活性在80%以上。脂肽能抑制多种常见的食源性致病菌,包括革兰氏阳性菌如蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌、藤黄微球菌等以及革兰氏阴性菌如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、痢疾志贺氏菌等。同商业化应用的乳酸链球菌素(nisin)和多粘菌素相比,菌株XZQ-16脂肽除了对细菌具有明显抑制作用,还对真菌如白色念珠菌、毕赤酵母和黑曲霉也有抑制作用。B.coagulans XZQ-16脂肽表现出极高的稳定性和广谱抗菌活性,为在食品、畜牧、医药、化妆品及植物保护等领域的应用奠定理论基础。; 高兆建王秋芬胡鑫强宋玉林赵宜峰陈腾; 关键词：脂肽凝结芽孢杆菌纯化抗菌特性

筛选自泡菜的发酵乳杆菌细菌素纯化及抑菌特性分析被引量：10: 2021年; 从中国传统发酵蔬菜中筛选鉴定对食源性致病菌有广谱抗性的细菌素(命名为BLF52)产生菌株并对细菌素分离纯化和抑菌特性分析。分子筛凝胶过滤层析和半制备高效液相色谱(RP-HPLC)纯化细菌素并用Tricine-SDS-PAGE法测定其分子量。筛选得到产细菌素的发酵乳杆菌(Lactobacilus fermentum)CH-16。MRS培养基中34℃发酵至稳定期前期即24~30 h对S.aureus抑制活性最大(875 AU/mL)。BLF52纯化至单一组分,分子量5.6 kDa,40~80℃(30 min)、pH2.0~7.0(2 h)有良好稳定性。胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K处理后,抑菌活性完全丧失,α-淀粉酶对其无影响,表明BLF52有典型的细菌素特性。BLF52对食源性腐败菌和致病菌如单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和副溶血性弧菌均有抑制活性,通过杀菌模式抑制培养中的S.aureus生长。细菌素BLF52有潜力开发为适合酸性或中性食品使用的食品防腐剂。; 高兆建张艳秋宋玉林赵宜峰; 关键词：细菌素发酵乳杆菌分离纯化抑菌特性

产黄青霉抗真菌几丁质酶的纯化及特性分析被引量：5: 2021年; 为实现抗真菌性能的耐热新型几丁质酶在食品防腐及生物防治方面的应用,从产黄青霉Xch23中分离纯化几丁质酶(Chi-Pc76)并研究其应用特性。通过硫酸铵沉淀、DEAE-Cellulose A52离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析纯化得到均一的Chi-Pc76。最终得到Chi-Pc76纯化倍数17.1倍,回收率21.6%,比活力为584.8 U/mg。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得Chi-Pc76分子质量61 kDa。纯化后的Chi-Pc76最佳反应条件为pH 6.0、温度55℃。Chi-Pc76在宽泛的pH 4.0~10.0之间稳定性强,其显著的热稳定性可达到70℃。ChiPc76对底物胶体几丁质具有高的底物特异性,对乙二醇几丁质、α-几丁质、β-几丁质有中等活性,而对其他受试底物无活性或痕量活性。以胶体几丁质为底物K_(m)和V_(max)值分别为0.25 mg/mL和20μmol/(min·mg)。金属离子Ca^(2+)、Ba^(2+)、K^(+)、Na^(+)对酶有明显激活作用;十二烷基硫酸钠、吐温80、苯甲基磺酰氟和尿素对酶活力基本无影响,但Mn^(2+)、Co^(2+)、Fe^(2+)、Ag+、Cu^(2+)、Zn^(2+)、Pb^(2+)、Hg^(2+)和β-巯基乙醇、二硫苏糖醇均对酶活力有抑制作用。Chi-Pc76对黑曲霉、黄曲霉、尖孢镰刀菌和橘青霉均有显著的抗真菌活性,对比文献为产黄青霉抗真菌几丁质酶。鉴于Chi-Pc76纯化简便、热稳定性好、宽广的pH值稳定性、高效降解几丁质和抗真菌等特点,产黄青霉Xch23几丁质酶在几丁质废料综合利用、生物转化药理活性产品、食品保鲜以及植物病原性真菌和昆虫幼虫生物防治等方面具有潜在价值。; 高兆建丁飞鸿陈欢耿云龙赵宜峰; 关键词：几丁质酶产黄青霉分离纯化酶学特性抗真菌

抑制食源性致病菌脂肽的分离鉴定及生物学特性分析被引量：5: 2022年; 从传统香肠中分离拮抗芽孢杆菌菌株,并对菌株所产脂肽进行分离纯化和抗菌特性分析。采取平板对峙法筛选产生抗菌脂肽的芽孢杆菌菌株。抗菌脂肽采用有机溶剂萃取、Sephadex LH-20柱层析、半制备反向高效液相色谱(reverse-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)分离纯化,傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)扫描、薄层层析(thin-layer chromatography,TLC)-生物自显影鉴定,扫描电镜分析脂肽抗菌机理。分离筛选到1株产广谱抗菌脂肽的菌株,鉴定为短小芽孢杆菌(命名为XZK-18)。菌株XZK-18发酵8 h开始合成脂肽,24 h产量达到最大。TLC初步鉴定抑菌活性成分为脂肽,且主要由脂肽家族中的表面活性素(surfactin)及少量伊枯草菌素(iturin)组成,TLC-生物自显影检测到表面活性素对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有显著抑菌活性。FT-IR进一步证实抑菌活性成分为脂肽。扫描电镜结果表明,纯化的脂肽通过破坏大肠杆菌细胞膜完整性、使细胞壁穿孔、增大细胞膜通透性杀灭大肠杆菌。抗菌脂肽有广谱抑菌活性,对革兰氏阳性菌如蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌和单核增生李斯特菌有显著抑菌活性,对革兰氏阴性菌如铜绿假单胞菌、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、副溶血性弧菌和福氏志贺氏菌也有一定抑菌作用,对所试真菌无抑菌活性。脂肽在110℃以下保温30 min稳定性好,在pH 3~11下处理10 d抑菌活性保持稳定。以上特性表明菌株XZK-18合成的脂肽在食品生产与加工中有作为天然食品防腐剂的潜力。; 丁飞鸿耿云龙樊士德彭双双邹曦赵宜峰陈腾高兆建; 关键词：短小芽孢杆菌脂肽抗菌作用

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苏北科技发展计划项目(BC2013417)

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