国家自然科学基金(30270663)
- 作品数：12 被引量：29H指数：4
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- G1期细胞周期相关蛋白对POLD1基因启动子活性的调控被引量：4
- 2007年
- POLD1基因编码DNA聚合酶δ的催化亚基.然而作为最重要的复制蛋白,目前并不清楚其表达的细胞周期调控机制.研究中运用细胞周期同步化及荧光素酶报告基因测定了POLD1启动子在细胞周期不同时相的活性,结果显示启动子活性随着细胞周期进程而变化,在早S期最高.为进一步确定调控POLD1表达的细胞周期相关因子,应用不同质粒转染MCF7细胞,分别筛选得到稳定细胞系.荧光素酶实验表明增强p53或p21的表达,抑制CyclinE或CDK2的表达都能抑制POLD1启动子活性;而抑制CDK4或Cyclin D1的表达对启动子活性没有明显影响.瞬时共转染实验进一步验证Cyclin E或CDK2受到抑制后能够降低POLD1启动子活性.研究初步探讨了POLD1基因表达的细胞周期调控通路,进一步了解细胞周期因子对DNA复制体调控的复杂机制.
- 徐恒朱晓宇张海江石磊李莉宋楠萌桑建利
- 关键词：细胞周期调控启动子
- 蛋白磷酸酶4的组成与主要功能被引量：1
- 2006年
- 在蛋白质的可逆磷酸化过程中,蛋白激酶和蛋白磷酸酶有着同等重要的作用。近年来,人们逐渐把研究的重点转移到以往关注甚少的蛋白磷酸酶家族上。蛋白磷酸酶4(PP4或PPX)是蛋白磷酸酶2A(PP2A)家族的重要成员之一,它与多个调节亚基形成多种复合体参与诸多重要的细胞进程,如中心体的成熟、剪接体复合体的组装、多个细胞信号通路的调节以及DNA损伤修复的调节等多个事件。现对PP4的组成、活性调节及已知的生物学功能作简要介绍。
- 黄秀清宁丽峰龙治涛孙玲玲桑建利
- 关键词：可逆磷酸化蛋白磷酸酶4DNA损伤修复
- P53亚细胞定位变化对POLD1基因启动子活性的影响被引量：11
- 2006年
- POLD1基因编码DNA聚合酶δ(pol δ)的催化亚基．体外实验表明p53能够抑制POLD1 基因启动子活性．文中探讨p53是否在细胞内直接与POLD1启动子结合调节POLD1基因表达．在瞬时转染pEGFP-p53重组质粒的人乳腺癌MCF7细胞中,p53表达增强;RT-PCR结果显示 POLD1基因mRNA表达受到抑制．染色体免疫共沉淀和荧光素酶报告基因实验证明p53在细胞内与POLD1启动子直接结合抑制其启动子活性．荧光显微镜观察发现EGFP-p53在G1期进入细胞核而在S期和G2期则被转运至细胞质．在稳定表达的pEGFP-p53细胞系中,细胞周期同步化后POLD1启动子活性在细胞周期各时相均处于较低水平．证明了细胞内p53高表达后通过直接与 POLD1启动子结合而抑制POLD1基因表达,且这种抑制作用不受细胞周期进程的影响．
- 朱晓宇徐恒李莉张海江宋楠萌孙建华石磊桑建利
- 关键词：启动子P53细胞周期CHIP
- 蛋白磷酸酶4在人肺癌细胞A549增殖中的功能分析被引量：5
- 2006年
- 蛋白磷酸酶4(PP4)是PP2A亚家族的重要成员之一.已有研究表明PP4在果蝇与线虫中参与了中心体成熟,但作为一个进化上高度保守的蛋白质,PP4在哺乳动物细胞中的确切功能至今仍知之甚少.选择人肺癌细胞A549为材料,转染发夹型siRNA表达质粒,筛选鉴定获得了PP4表达抑制细胞株,然后对细胞的形态、生长特性及有丝分裂过程进行观察分析.与对照细胞相比,发现其生长速率明显减慢,细胞群体中DNA含量为4N的细胞比率明显增高.这一结果是由细胞群体中出现了高比例的多核细胞造成的,进一步的分析揭示,高比例多核细胞的产生是由于PP4表达下降,致使细胞有丝分裂和胞质分裂受到严重干扰所导致的.由此推测PP4对于保证细胞有丝分裂及胞质分裂的正常进行具有重要作用,PP4受到抑制将会导致多核细胞的产生,进而抑制A549细胞的增殖.
- 黄秀清龙治涛宁丽峰孙玲玲桑建利
- 关键词：细胞周期有丝分裂胞质分裂
- 增强p53、p21及抑制c-myc表达对MCF-7细胞增殖的协同抑制作用被引量：2
- 2005年
- 为了探讨增强p53、p21基因表达水平和降低c-myc基因表达水平对乳腺癌细胞MCF-7增殖的协同抑制作用,以及这些基因对细胞产生效应时的相互关系,本研究中首先构建了正义的p53、p21和反义的c-myc3种真核细胞表达载体,并根据析因实验设计三种载体不同剂量组合。按照组合用质粒转染细胞,然后对转染细胞的增殖抑制率进行检测,并采用金正均Q值法、单因素方差分析中的LSD法、聚类分析法等统计学方法对结果进行统计分析。结果显示,不同量的p53、p21反义c-myc对MCF-7细胞的增殖均有抑制作用,抑制的程度各基因间存在差异。在各基因组合中,p21与反义c-myc,p53与反义c-myc联用具有协同作用,对MCF-7细胞的增殖产生更强的抑制,而p53与p21之间未显示出协同作用。对三基因协同结果进行聚类分析后,发现第一类组合协同作用最明显,第九类组合的抑制率最高。由此推测,作为抑癌基因的p53或CDK抑制基因p21高表达,同时原癌基因c-myc表达受到抑制,可相互协同显著增强对MCF-7细胞增殖的抑制作用。
- 张海江王楠朱晓宇桑建利何大澄
- 关键词：MCF-7细胞增殖真核细胞表达载体转染细胞
- p21对DNA聚合酶δ表达的抑制及其对MCF7细胞增殖和恶性表型的影响被引量：4
- 2006年
- 细胞周期抑制因子p21能影响G1／S期转换和G2／M期进程,进而抑制细胞增殖．p21表达增高可以抑制多个DNA复制相关基因表达．DNA聚合酶δ是DNA复制中最为重要的复制酶, p21是否抑制它的表达,并通过这种作用影响细胞增殖及细胞恶性表型的变化,至今还没有报道．本研究观察到p21表达增强的MCF7-p21细胞生长速率变慢,血清依赖性增强,细胞的锚定和非锚定依赖性增殖都受到抑制,表明p21表达增加对细胞增殖和细胞恶性表型的产生有重要作用．而Western blot检测发现在p21表达增高的MCF7-p21细胞中,聚合酶δ(p125亚基)表达下降． p21高表达抑制POLD1启动子活性,这种抑制作用具有p21剂量依赖效应．这表明p21表达增高对细胞增殖的抑制和细胞恶性表型的影响可能是通过抑制在DNA复制中最重要的聚合酶δ(p125) 的表达来实现的．这可能是p21对细胞增殖及恶性表型影响的一个新的调控机制．
- 石磊徐恒朱晓宇孙建华宋楠萌李莉桑建利
- 关键词：P21细胞增殖DNA聚合酶Δ
- 中心体异常在咖啡因增强顺铂杀伤人肝癌细胞系中的作用被引量：1
- 2004年
- 为了探讨咖啡因是否影响细胞周期检验点而增强顺铂杀伤肿瘤细胞及其作用机制 ,选取同步化于S期的肝癌细胞系SMMC 772 1,用顺铂和咖啡因进行不同方式的处理 ,包括顺铂处理、咖啡因处理以及先经顺铂 ,再用咖啡因处理 .利用相关方法对不同处理的细胞进行了分析 ,包括细胞形态 ,细胞生长速率 ,多核细胞的形成与死亡 ,中心体的异常等 .结果显示 ,顺铂与咖啡因联合处理的细胞出现明显的多核化现象 ,多核细胞占总细胞的百分比可以达到 30 %以上 ,高于用顺铂或用咖啡因处理的细胞 .同时观察到多核细胞生存能力较差 ,它们会通过细胞凋亡的形式死亡 .抗中心体人自身免疫血清的免疫荧光结果显示 ,中心体异常与多核细胞的形成直接相关 .在部分多核细胞的核周围有多个不同强度的荧光点 ,在另部分多核细胞中 ,在其中央有一个大的荧光点 ,被多个细胞核围绕 ,荧光较强 .根据结果推测 ,由多个不完整的中心体导致的多极分裂形成多核细胞 ,随后多个中心体聚集到中央形成大的中心体 ,负责间期微管的组装 .结果表明 ,受到顺铂损伤的细胞由于检验点的作用而使细胞周期阻断 ,咖啡因可消除周期的阻断 ,使细胞在中心体未完成正常复制状态下进入有丝分裂 ,产生大量多核细胞 ,这些多核细胞最终发生凋亡 .
- 齐建国桑建利林海燕陈晓波王永潮
- 关键词：中心体顺铂咖啡因
- MCF-7细胞瞬时基因表达转染模式的建立
- 2005年
- 目的 建立一种高效、简便、低毒、价廉的瞬时基因表达细胞转染模式。 方法 选择人乳腺癌细胞 系MCF 7,采用Polyethylenimine(PEI)作为转染剂,对细胞密度、载体DNA量、PEI氮与DNA磷的比率(PEI N∶DNA P) 以及PEI DNA混合物与细胞共存的无血清培养时间等对转染效率的影响进行了比较分析。 结果 转染时的24 孔板每孔接种的细胞以2×105为宜,PEI N∶DNA P的最优比率不是固定的,它与转染时DNA的量有关,每孔转染1 μgDNA时其最优PEI N∶DNA P比率为33∶1左右,而每孔转染4μgDNA时其最优PEI N∶DNA P比率为9∶1左右。 另外,PEI DNA混合物与细胞共存的无血清培养时间至少需要3h,最佳时间为5～7h。 结论 利用转染剂PEI, 控制合适的细胞密度、DNA质量、PEI N∶DNA P比率和无血清培养的时间,可成为一种高效、简便、低毒、价廉的瞬时 基因表达的细胞转染模式。
- 张海江韩世炜桑建利何大澄
- 关键词：细胞转染
- p53对人乳腺癌细胞MCF-7生长及周期相关基因的影响被引量：4
- 2005年
- 目的探讨抑癌基因p53对人乳腺癌细胞MCF-7生长以及周期相关基因cyclinD1、cyclinE、CDK2和CDK4表达的影响。方法将正义的p53真核表达载体导入MCF-7细胞,获得稳定表达正义p53的细胞模型,并经PCR和Western blot鉴定。分析了细胞的各种生长特性包括生长曲线、血清依赖、单细胞克隆形成、软琼脂成集落等;利用TdR双阻断法同步化细胞,流式细胞术分析了细胞周期;Western blot检测了其他周期相关基因的表达。结果p53的高表达可以使细胞的生长速度减慢、血清依赖性增加、单细胞克隆成集落能力降低、非锚定依赖性生长能力减弱,S期的进程减缓,一定程度上抑制cyclinD1和CDK2的表达,cyclinE和CDK4的表达未见明显变化。结论抑癌基因p53的表达能够抑制人乳腺癌细胞MCF-7的生长,并可能通过阻抑cyclinD1和CDK2的表达而阻抑细胞周期S期进程,实现其调节功能。
- 张海江孙建华朱晓宇桑建利何大澄
- 关键词：乳腺癌细胞周期抑癌基因P53
- 真核细胞DNA聚合酶δ的结构与功能被引量：3
- 2004年
- DNA聚合酶δ(Polδ)在真核细胞的DNA复制过程中具有核心酶的作用,同时还参与DNA的修复。Polδ是一种由多个亚基组成的复合体,目前已从哺乳动物、裂殖酵母和芽殖酵母等多种真核生物细胞中分离出,并对它们的亚基组成进行了分析,但还未得到确切一致的结果。Polδ在DNA复制中的具体作用已基本了解,它参与催化整个前导链的复制以及一些或大部分滞后链的复制。此外,Polδ还参与DNA的修复,此酶的这一功能可减少DNA的变异,但目前对其作用机理还知之较少。在Polδ活性调控方面,主要研究了一些相关蛋白因子对Polδ活性的调控作用以及转录因子对催化亚基表达的调控作用。
- 张海江韩世炜桑建利
- 关键词：真核细胞DNA聚合酶DNA
