目的:建立重组 hPK-5质粒 DNA 基因治疗制剂的质量标准和检测方法。方法:采用限制性酶切图谱分析鉴定质粒DNA 结构和 PCR 法鉴定插入的 hPK-5基因作鉴别试验;采用分光光度法测定质粒 DNA 含量和 A_(260)/A_(280)比值;采用琼脂糖凝胶电泳法分析质粒 DNA 的超螺旋构象比例和残留 RNA 含量;采用阴离子交换色谱法分析 HPLC 纯度;采用 ELISA 法测定hPK～5蛋白的表达量;采用内皮细胞迁移法测定 hPK-5蛋白的生物学活性。结果:重组质粒 DNA 的限制性酶切片段大小与理论值一致;插入基因 PCR 扩增片段大小与理论值相符;质粒 DNA 含量为1.12 mg·mL^(-1);A_(260)/A_(280)比值为1.83;琼脂糖凝胶电泳法测定超螺旋构象质粒的比例为95.4%;HPLC 测定超螺旋质粒 DNA 占93.8%,开环质粒 DNA 占6.2%,琼脂糖凝胶电泳法测定木检出 RNA 残留;没有检出其他杂质;以2μg重组 hPK-5质粒转染5×10~5Hela 细胞48 h 后,2 mL 培养上清中 hPK-5蛋白浓度为109 ng·mL^(-1);以培养上清进行内皮细胞迁移试验,转染重组 hPK-5质粒 DNA 组迁移的内皮细胞数明显少于对照绀(P<0.05)。其他项目均符合相应的规定。结论:建立了重组 hPK-5质粒 DNA 基因治疗制剂的检定方法及其质量标准,为有效控制该类产品的质量打下基础。
