广东省自然科学基金(10151051501000088)
- 作品数：2 被引量：1H指数：1
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- 酸性成纤维细胞生长因子基因真核表达载体的构建及转染肌卫星细胞
- 2012年
- 目的探讨通过构建酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）基因真核表达载体转染大鼠肌卫星细胞（MSCs）建立细胞工程种子细胞可行性。方法首先提取人类肌肉组织总RNA，RT-PCR法调取aFGF基因，然后用直接化学合成法合成人类白细胞介素2信号肽序列（SPS），通过基因融合得到SPS-aFGF,再通过定向克隆到真核表达载体pEGFP-N1，最终得到重组质粒PEGFP-N1-SPS-aFGF，对重组质粒做测序和酶切鉴定；差速贴壁法获取大鼠MSCs，观察细胞形态，做免疫荧光鉴定；经鉴定正确的细胞随机分为3组：目的基因组（aFGF加N1）、空载质粒组（N1）、空白对照组（blank），前两组分别加入质粒PEGFP-N1．SPS-aFGF与pEGFP-N1质粒，空白对照不加入任何质粒，均在脂质体Lipofectamine2000TMReagent介导下转染，转染后荧光显微镜统计发绿色荧光的细胞占各组细胞比例，计算转染效率；转染72h后利用实时荧光定量PCR与Westernblot检测aFGF基因在MSCs中表达情况。结果①重组质粒测序结果与GenBank公布的序列一致，酶切鉴定条带与实际大小相符。②荧光显微镜下观察到转染细胞有荧光表达，并在转染72h达到最高峰。③转染后72h，实时荧光定量PCR结果显示目的基因组表达量平均相对比值（aFGF加N1）组（1464．96）显著高于N1组（1．016）、Blank组（1．000），差异有统计学意义（P〈0．05）。Westernblot检测显示aFGF表达呈极强阳性，而N1组及Blank组aFGF表达极弱。结论成功构建aFGF基因真核表达载体并转染MSCs，aFGF在MSCs内高表达，此种方法有希望获取具备特殊生物学功能细胞。
- 杨绍安蔡进奎肖晓桃周初松蔡宝塔
- 关键词：酸性成纤维细胞生长因子肌卫星细胞基因转染细胞工程
- 酸性成纤维细胞因子基因体外转染肌卫星细胞被引量：1
- 2013年
- 背景:研究报道外源性酸性成纤维细胞生长因子既可调节肌卫星细胞增殖和分化,又具有预防运动终板退变及肌萎缩的作用。目的:通过酸性成纤维细胞因子基因转染大鼠骨骼肌卫星细胞,检测目的基因转染肌卫星细胞效果及基因表达情况,探讨建立有效预防运动终板退变及肌萎缩种子细胞可行性。方法:取Wistar成年大鼠后肢肌肉,差速贴壁培养法分离纯化肌卫星细胞,观察细胞生长特性并做免疫组织化学鉴定;取第2代细胞,LipofectamineTM2000Reagent转染试剂介导,将重组真核表达质粒pEGFP-N1-aFGF转染肌卫星细胞为实验组;阴性对照组转染空载质粒pEGFP-N1;空白对照组仅加入转染试剂。转染后24-72h和传代后分别用倒置荧光显微镜观察细胞绿色荧光蛋白表达情况,计算转染效率。转染细胞行WesternBlot检测酸性成纤维细胞因子表达。提取转染后72h细胞总RNA,实时荧光定量PCR检测酸性成纤维细胞因子基因mRNA表达。结果与结论:分离纯化细胞经免疫组织化学鉴定为肌卫星细胞。荧光显微镜观察到细胞转染6h后即有绿色荧光发出,荧光强度和表达细胞总数在72h达到高峰,传代后仍可观察到绿色荧光蛋白表达。实时荧光定量PCR证实目的基因mRNA表达水平远远高于对照组,WesternBlot检测实验组有大量酸性成纤维细胞因子产生。提示酸性成纤维细胞基因转染肌卫星细胞可表达基因产物,有望作为基因工程种子细胞预防失神经支配后运动终板退变及肌萎缩。
- 杨绍安蔡进奎周初松肖晓桃肖莎邹晓英
- 关键词：酸性成纤维细胞生长因子基因肌卫星细胞转染运动终板失神经支配
