国家高技术研究发展计划(2007AA021202)
- 作品数：6 被引量：13H指数：3
- 相关作者：杨莉彭星辰王绍军张冬梅杨莉更多>>
- 相关机构：四川大学四川大学华西医院中国人民解放军第452医院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 分泌型重组mPSMA腺病毒的构建及表达被引量：3
- 2009年
- 目的构建分泌型重组小鼠前列腺特异膜抗原腺病毒(Ad-mPSMA),并检测其免疫效果。方法利用AdEasy重组腺病毒载体系统,通过PCR扩增小鼠PSMA全长序列,并在基因的5′端加上人IL-2的信号肽序列,亚克隆至pAdenoVator CMV5穿梭质粒,与pAdenoVatorΔE1/E3进行同源重组获得pAd-mPSMA重组质粒,经HEK293细胞包装扩增获得重组病毒颗粒。通过RT-PCR及Western blot检测小鼠PSMA基因在HeLa细胞中的转录及表达。以该重组腺病毒免疫小鼠,对mPSMA的特异性抗体进行检测。结果成功将mPSMA基因克隆至pAdenoVatorΔE1/E3载体上,病毒滴度为1.32×1011IU/mL,RT-PCR证实mPSMA的转录,Western blot证实mPSMA的分泌表达,并在小鼠血清中检测到mPSMA的特异性抗体。结论成功构建分泌型重组mPSMA腺病毒,为前列腺癌特别是激素难治性前列腺癌的预防和治疗提供了更广阔的前景。
- 张冬梅王绍军彭星辰杨莉
- 关键词：前列腺特异膜抗原腺病毒载体基因治疗
- 重组人内皮抑素腺病毒联合顺铂对小鼠结肠癌肺转移治疗作用研究被引量：3
- 2011年
- 目的观察重组人内皮抑素腺病毒（Ad-hE）联合顺铂（Cis）对小鼠结肠癌肺转移的治疗作用、不良反应,并初步探讨其作用机制,探索抗血管基因治疗联合化疗的可行性。方法 6~8周龄BALB/c小鼠每只尾静脉注射接种1×105CT26细胞,建立小鼠CT26结肠癌肺转移模型,随机分成5组,分别予Ad-hE和Cis单独及联合注射,以生理盐水及空腺病毒注射为对照,观察肿瘤抑制效应、肿瘤血管生成、肿瘤细胞凋亡情况和可能发生的毒副反应。结果与对照组相比,Ad-hE和Cis单药及联合治疗组小鼠肺转移瘤数量明显减少,且联合治疗组生存期延长。各治疗组肿瘤血管生成减少,肿瘤细胞凋亡增多,均以Ad-hE联合Cis组最明显。各组均未观察到明显不良反应。结论重组人内皮抑素腺病毒和顺铂联合应用可增强对小鼠结肠癌肺转移的抑制作用,其机理可能是通过抑制肿瘤新生血管形成和诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。
- 王炼杨莉吴扬敬新蓉王莉刘焕义李秋
- 关键词：肿瘤内皮抑素腺病毒
- Serratia marcescens非特异性核酸内切酶的原核表达及其应用被引量：3
- 2009年
- 目的在大肠杆菌中表达Serratia marcescens非特异性核酸内切酶(SMNE),并进行纯化、活性检测及应用。方法合成smne基因,应用PCR技术在基因的5′端引入6个组氨酸标签序列,将其插入分泌表达载体pET-20b(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达。表达产物经镍离子螯合琼脂糖凝胶一步纯化后,检测其活性并计算比活。将纯化的SMNE用于重组腺病毒的制备,对外源性核酸进行降解,并采用Southern blot对外源性DNA残留量进行测定。结果重组表达质粒pET-20b-smne经PCR、双酶切和测序证明构建正确。重组蛋白的表达量为8.0 mg/L,纯化后纯度达95%,比活达1.1×106 U/mg。在重组腺病毒制备过程中使用后,成品中的外源性DNA残留量≤10 ng/5.0×1011 VP。结论已成功地在大肠杆菌中表达了SMNE,纯化的SMNE活性高,有望应用于重组生物制品制备过程中外源性核酸的去除。
- 张开俊杨莉
- 关键词：SERRATIA原核表达
- 重组内皮抑素腺病毒联合卡铂抗小鼠肺癌的实验研究被引量：1
- 2010年
- 目的将重组内皮抑素腺病毒(Ad-E)和化疗药物卡铂联合治疗小鼠Lewis肺癌,观察其对肿瘤的抑制作用以探索其在肺癌治疗中的可行性。方法建立小鼠LL/2肺癌模型,将荷瘤小鼠随机分为5组:生理盐水(NS)组,空载腺病毒(Ad-null)组,卡铂组,Ad-E组,Ad-E+卡铂组;观察肿瘤体积、瘤重、小鼠生存期、肿瘤血管生成、肿瘤细胞凋亡及治疗毒副反应。结果与Ad-E或卡铂单药组相比,联合治疗组的肿瘤生长减慢,瘤重减轻,小鼠生存期延长,肿瘤组织微血管密度减少,肿瘤细胞凋亡增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。各治疗组小鼠均未出现明显毒副反应。结论以腺病毒为载体的抗血管基因治疗联合化疗有较好的抑制小鼠Lewis肺癌效应,且无明显毒副作用。
- 廖加群苏晓庆彭星辰石华山张海龙杨莉
- 关键词：内皮抑素卡铂基因治疗肺癌
- 大鼠前列腺特异膜抗原基因重组腺病毒诱导小鼠特异性抗体的研究
- 2011年
- 目的构建含大鼠前列腺特异膜抗原基因(PSMA)的重组腺病毒Ad-rPSMA,并研究其在小鼠体内的特异性体液免疫反应。方法提取大鼠脑组织总RNA,经RT-PCR扩增PSMA基因片段,利用Adeasy腺病毒载体系统构建pAd-rPSMA重组腺病毒质粒,包装复制缺陷型重组腺病毒Ad-rPSMA,制备病毒颗粒。用制备的病毒感染HeLa细胞,Western blot检测PSMA基因的表达。以Ad-rPSMA重组腺病毒免疫C57小鼠,检测血清中PSMA特异性抗体。结果成功构建了含有大鼠PSMA基因的重组腺病毒,制备的病毒颗粒数为1.97×1012VP/mL,A260/A280值为1.32,病毒滴度为5×1010IU/mL;Western blot检测可见大鼠PSMA基因在HeLa细胞中的表达;ELISA法检测出免疫小鼠血清中存在PSMA特异性抗体。结论成功构建了大鼠前列腺特异膜抗原基因重组腺病毒Ad-rPSMA,并诱导小鼠产生了针对PSMA的特异性抗体。
- 王绍军张冬梅杨莉
- 关键词：前列腺癌前列腺特异膜抗原腺病毒载体
- 新型重组AAV5/5载体及包装系统被引量：3
- 2010年
- 本研究组建了一种可用于规模化生产的以重组单纯疱疹病毒为辅助病毒的AAV5/5载体包装系统。首先,将5型腺相关病毒(AAV5)的rep和cap基因插入I型单纯疱疹病毒(HSV-1)基因组非必需基因UL2中,获得重组病毒rHSV1-rep5cap5。其次,构建一种携带AAV5ITR的通用型载体质粒pAAV5neo,将报告基因EGFP插入pAAV5neo中,得到pAAV5neo-EGFP质粒。将pAAV5neo-EGFP质粒导入BHK-21细胞,用G418选择培养,挑选出表达EGFP并在重组病毒rHSV1-rep5cap5感染下能高效产生rAAV5/5-EGFP的单克隆载体细胞株C020。用rHSV1-rep5cap5感染C020细胞制备rAAV5/5-EGFP,用"氯仿处理-聚乙二醇/氯化钠-氯仿抽提"方法粗纯化rAAV5/5-EGFP。用100kDa分子量截流超滤方法进一步纯化和浓缩,获得高纯度的rAAV5-EGFP。SDS-PAGE电泳分析可见3条特征性外壳蛋白带。电镜分析显示病毒颗粒以实心颗粒为主。用rAAV5/5-EGFP病毒按1×105vg/cell感染体外培养的HEK293细胞,可见30%细胞呈现绿色荧光。本研究提出了一种高效AAV5/5载体生产系统和纯化方法,为重组AAV5载体的进一步应用提供了基础。
- 董小岩田文洪袁振华谭淑萍吴小兵
- 关键词：病毒载体
