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国家自然科学基金(30470865): 作品数：11 被引量：28H指数：4; 相关作者：凌贤龙张国桥何玉琦周源李诗伟更多>>; 相关机构：第三军医大学新桥医院成都军区昆明总医院解放军531医院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金更多>>; 相关领域：医药卫生生物学更多>>

细胞融合法转线粒体细胞模型的构建及鉴定: 2009年; 目的探讨细胞融合方法建立转线粒体细胞(cybrid)可行性,并对融合后细胞内mtDNA进行鉴定。方法采用细胞融合方法将正常人血小板与mtDNA缺失人肝癌细胞(ρ°SK-Hep1)融合,建立转线粒体细胞(SK-Hep1 Cyb),恢复细胞正常线粒体功能。并用PCR、Southern杂交、Western杂交及线粒体膜电位检测进行鉴定。结果PCR、Southern杂交、Western杂交及线粒体染色证实成功建立了ρ°SK-Hep1细胞转线粒体模型SK-Hep1Cyb。结论采用细胞融合法可以建立转线粒体细胞,融合细胞恢复线粒体功能,转线粒体细胞可稳定存活30d以上。; 何玉琦乌秀敏凌贤龙周源李诗伟李歆强晏斌; 关键词：线粒体DNA 融合细胞肝癌

细胞色素氧化酶Ⅱ在无线粒体DNA肝癌细胞系及亲本细胞系中表达的实验研究被引量：2: 2006年; 目的:探讨细胞色素氧化酶亚基Ⅱ(cytochromeoxidasesubunitⅡ)在无线粒体DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)肝癌细胞系及亲本细胞系中DNA、RNA及蛋白水平的表达。方法:通过southernblotting、RT-PCR、Northernblotting、Westernblotting来检测细胞色素氧化酶Ⅱ的表达。结果:细胞色素氧化酶亚基Ⅱ在无线粒体DNA肝癌细胞系中DNA、RNA、蛋白水平上无表达。结论:细胞色素氧化酶Ⅱ在无线粒体DNA肝癌细胞中较之亲本细胞在DNA、RNA及蛋白水平上的表达存在很大的差异,为我们进一步了解无线粒体DNA的生化特性提供实验依据。; 张国桥凌贤龙陈正堂; 关键词：线粒体DNA 肝细胞癌 SOUTHERN杂交

诱导细胞mtDNA缺失以及再转入线粒体后对肿瘤细胞凋亡的影响被引量：5: 2009年; 目的对比研究mtDNA缺失以及再转入线粒体后细胞凋亡的变化。方法在成功构建ρ0SK-Hep1细胞和转线粒体细胞SK-Hep1 Cyb的基础上,采用Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡;流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)和线粒体膜电位(ΔΨm);Western blot检测细胞Bcl-2、Bax表达水平;免疫荧光染色观测Bcl-2细胞内分布。结果SK-Hep1、ρ0SK-Hep1和SK-Hep1Cyb细胞凋亡率分别为(2.01±0.11)%、(0.37±0.08)%和(2.10±0.12)%。ρ0SK-Hep1对细胞凋亡有明显抗性(P<0.05)。ρ0SK-Hep1细胞内DCFDA荧光强度较SK-Hep1细胞显著增强(35.5与15.9,P<0.01);转入线粒体后,SK-Hep1Cyb细胞DCFDA荧光强度较ρ0SK-Hep1细胞明显下降(17.4与35.5,P<0.01)。ρ0SK-Hep1细胞MitoTracker Red荧光强度较SK-Hep1细胞显著减低(55.0与65.9,P<0.05);转入线粒体后,SK-Hep1Cyb细胞MitoTrack-er Red荧光强度与SK-Hep1细胞基本一致(67.4与65.9,P>0.05)。ρ0SK-Hep1细胞线粒体Bcl-2、Bax表达增多,Bcl-2/Bax比值增加(P<0.01)。SK-Hep1Cyb细胞线粒体Bcl-2/Bax值下降。结论mtDNA缺失肿瘤细胞对细胞凋亡有明显拮抗。Bcl-2线粒体转位、线粒体Bcl-2/Bax值增加、ROS产生增多可能参与细胞凋亡拮抗的形成。; 李歆强凌贤龙周源何玉琦李诗伟晏斌; 关键词：线粒体DNA ROS 细胞凋亡肿瘤

线粒体DNA损伤与人肝癌细胞多药耐药关系的研究被引量：4: 2009年; 目的:建立线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)缺失肝癌SK-Hep1细胞(ρ°SK-Hep1)的转线粒体模型(cybrid,Cyb),探讨mtDNA缺失诱导人肝癌细胞多药耐药表型产生的可能机制。方法:采用聚乙二醇融合法,将正常人血小板融合入ρ°SK-Hep1细胞,建立ρ°SK-Hep1细胞转线粒体模型SK-Hep1Cyb,并采用PCR、Southern杂交进行鉴定;计数法描绘细胞生长曲线,计算倍增时间;Transwell实验检测细胞侵袭能力,MTT法检测药物敏感性,Western印迹法检测细胞中P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1,MRP1)和Bcl-2的表达水平。结果:PCR、Southern杂交证实ρ°SK-Hep1融合了正常人血小板线粒体,成功建立了转线粒体细胞模型SK-Hep1Cyb。ρ°SK-Hep1细胞群体倍增时间明显缩短(P<0.01),生长速度加快,侵袭能力增强;与SK-Hep1细胞和SK-Hep1Cyb细胞相比,ρ°SK-Hep1细胞对化疗药物耐药性增强,细胞内P-gp、MRP1和Bcl-2蛋白表达增加。结论:采用细胞融合技术成功建立了ρ°SK-Hep1细胞的转线粒体模型。P-gp、MRP1和Bcl-2蛋白表达增加在mtDNA缺失诱导多药耐药表型产生中可能具有一定的作用。; 何玉琦凌贤龙于金秋李诗伟周源李歆强晏斌; 关键词：肝肿瘤 DNA 线粒体多药耐药相关蛋白质类

线粒体DNA缺失SK-Hep1细胞转线粒体模型的建立及生物学特性分析被引量：10: 2009年; 建立了线粒体DNA缺失SK-Hep1细胞(ρ°SK-Hep1)转线粒体的模型(SK-Hep1Cyb),并探讨了线粒体DNA缺失对肝癌细胞恶性表型的影响。以正常人血小板为外源性线粒体供体,采用聚乙二醇融合方法建立ρ°SK-Hep1细胞转线粒体模型SK-Hep1Cyb,并以PCR、Southern杂交及Western杂交进行鉴定,MTT法测定生长曲线,Transwell实验检测细胞侵袭能力,Western杂交检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达情况。PCR、Southern杂交及Western杂交证实成功建立了ρ°SK-Hep1细胞转线粒体模型SK-Hep1Cyb。与SK-Hep1和ρ°SK-Hep1细胞相比,SK-Hep1Cyb细胞群体倍增时间明显延长,生长速度减慢,侵袭能力明显下降,抗凋亡能力下降;而ρ°SK-Hep1细胞与母本细胞相比生长速度与侵袭能力明显增强,抗凋亡能力增强。采用细胞融合技术成功建立了ρ°SK-Hep1转线粒体模型。融合细胞肿瘤恶性相关表型如生长速度、侵袭能力、抗凋亡能力明显下降。线粒体DNA损伤对肝癌细胞恶性表型可能有影响,而恢复正常线粒体功能后或可逆转恶性表型。; 何玉琦凌贤龙; 关键词：线粒体DNA 融合细胞恶性表型

P-糖蛋白线粒体转位与线粒体DNA缺失肿瘤细胞多药耐药产生的关系被引量：2: 2011年; 线粒体DNA缺失细胞(ρ~0细胞)拮抗化疗药物诱导的凋亡,但其确切机制尚不明确。本研究探讨P-gp线粒体转位与人肝癌细胞(SK-Hepl)mtDNA缺失细胞(ρ~0SK-Hep1)多药耐药产生的关系。以SK-Hep1、ρ~0SK-Hep1和转线粒体细胞SK-Hep1Cyb为研究对象,CCK-8方法检测细胞对药物敏感性;AnnexinV/PI双染法及DAPI染色法检测细胞凋亡;Westernblot检测P-gp表达;激光共聚焦显微镜结合免疫荧光检测P-gP细胞内分布。结果显示,SK-Hep1、ρ~0SK-Hep1和SK-Hep1Cyb细胞对多柔比星(DOX)的IC_(50)分别为0.62±0.02μg/ml、4.93±0.17μg/ml和0.57±0.02μg/ml。SK-Hep1、ρ~0SK-Hep1和SK-Hep1Cyb细胞凋亡率分别为1 1.25%±1.36%、4.75%±0.98%和14.50%±1.57%,ρ~0SK-Hep1对细胞凋亡有明显抗性。Western blot检测发现ρ~0细胞内P-gP、Bax、Bcl-2表达增加,Bcl-2/Bax比值增加。免疫荧光共定位显示,ρ~0细胞线粒体内P-gP表达增加。结果表明,ρ~0细胞对化疗药物诱导的凋亡有明显抵抗,这种现象可能与ρ~0细胞P-gP、Bax、Bcl-2表达增加有关。ρ~0细胞P-gP线粒体转位可发挥外排泵作用将药物排出线粒体,改变化疗药物的亚细胞分布,减少细胞内药物浓度,使细胞产生多药耐药。; 凌贤龙何玉琦周源文蕾; 关键词：P-糖蛋白多药耐药线粒体DNA 肿瘤

人线粒体DNA缺失肝癌细胞株建立被引量：10: 2007年; 人线粒体DNA缺失肝癌细胞株(ρ0SK-Hep1)的建立及鉴定。采用溴化乙锭(EB)诱导,PCR、Southern杂交及选择性培养方法进行鉴定。ρ0SK-Hep1细胞在含EB、无尿嘧啶和丙酮酸的选择培养基中从第1天始细胞逐渐悬浮、肿胀,培养第5天以后大量悬浮死亡,且贴壁疏松,10～12天细胞完全悬浮死亡。在选择性培养基中可以正常生长增殖成单层,有少量悬浮。同期非选择培养的SK-Hep1细胞生长正常。PCR结果显示,细胞色素氧化酶I、II(COXI、COXII)及内参G3PDH在SK-Hep1细胞中均可扩增出相应的条带,ρ0SK-Hep1细胞只见内参条带的形成。Southern杂交结果显示,ρ0SK-Hep1细胞未见COXI、COXII杂交条带形成。经EB诱导后成功地获得了ρ0SK-Hep1细胞株。; 张国桥凌贤龙陈正堂; 关键词：溴化乙锭 SOUTHERN杂交线粒体DNA 肝癌

线粒体DNA缺失细胞的培养方法及评价: 2011年; 线粒体DNA缺失细胞（RHO0、ρ0）是指一类线粒体内DNA缺失、无线粒体功能、依靠糖酵解存活的细胞系。关于线粒体基因表达的调控和核基因的作用目前了解得很少,特别是线粒体基因组及其功能对线粒体核基因表达的影响,; 张国桥陈宏

线粒体DNA缺失肝癌细胞内活性氧、线粒体膜电位变化实验研究被引量：5: 2007年; 目的比较活性氧、线粒体膜电位在线粒体DNA缺失肝癌细胞株SK-Hep1(ρ0SK-Hep1)与亲本细胞中的差别。方法采用溴化乙锭诱导制备ρ0SK-Hep1细胞株;荧光探针标记、流式细胞计数及激光共聚焦显微镜方法检测细胞内活性氧和线粒体膜电位。结果ρ0SK-Hep1细胞内活性氧荧光强度显著高于其亲本SK-Hep1细胞株(P<0.01),ρ0SK-Hep1肝癌细胞平均计数35.5,而SK-Hep1肝癌细胞平均计数15.9。ρ0SK-Hep1细胞线粒体膜电位显著低于亲本细胞(P<0.01),ρ0SK-Hep1细胞平均计数55.0,而SK-Hep1细胞平均计数65.9。结论线粒体DNA缺失后细胞内活性氧水平增加,而线粒体膜电位有所减低。; 张国桥凌贤龙陈正堂; 关键词：线粒体DNA 活性氧膜电位

细胞线粒体DNA缺失鉴定的Southern杂交方法的建立被引量：1: 2010年; 目的建立一种简便、快捷、准确检测细胞线粒体DNA缺失的方法。方法将线粒体DNA所编码呼吸链中细胞色素氧化酶(COX)的亚单位COXⅠ和COXⅡ分别作为Southern杂交的分子探针,鉴别细胞株的线粒体DNA是否完全缺失。进行生长营养缺陷鉴定,并从RNA及蛋白水平对结果进行验证。结果 Southern杂交显示,SK-Hep1细胞可见COXⅠ、COXⅡ杂交条带,ρ°SK-Hep1细胞(线粒体缺失细胞)未见杂交条带形成,作为对比试验的生长营养缺陷法、PCR、Northern杂交和Western杂交,所得结果与Southern杂交结果一致。结论成功建立了鉴定细胞线粒体DNA缺失的Southern杂交方法,该方法能简便、快捷、准确地鉴定细胞线粒体DNA缺失。; 何玉琦凌贤龙张国桥李诗伟乐湘华晏斌周源李歆强; 关键词：DNA 线粒体印迹法 DNA 基因缺失

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