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大鼠胰岛分离纯化新方法“两步过筛法”的建立及评估被引量：2: 2013年; 目的建立胆管内灌注胶原酶分离胰岛与适宜孔径滤网过筛相结合的快速纯化胰岛细胞的方法并评估这种方法的效果。方法清洁级8～12周龄Sprague-Dawley大鼠胆总管内灌注胶原酶消化、分离胰岛,分别采用Ficoll不连续密度梯度离心法和两次经不同孔径滤网过滤的两步过筛法纯化胰岛细胞,行双硫腙(dithizone,DTZ)染色、吖啶橙/碘丙啶(acridine orange/propidium iodide,AO/PI)双色荧光染色法分析分离胰岛的纯度与活率;行葡萄糖刺激—胰岛素释放试验检测细胞活性;采用免疫组化荧光染色法观察胰岛细胞胰岛素的合成功能。结果大鼠两步过筛法和胰岛密度梯度离心法胰岛细胞收获量分别782±115胰岛当量(IEQ)和598±135 IEQ,差异有统计学意义(P<0.01);纯度分别为90%～100%和65%～85%,活率分别为>95%和85%～95%。两步过筛法分离的胰岛葡萄糖刺激—胰岛素释放试验显示培养24 h后,高糖实验组胰岛素浓度(76.9±6.1μg/L)显著高于刚分离纯化后即加入高糖刺激时的浓度(49.4±3.9μg/L),差异有统计学意义(P<0.01)。结论两步过筛法分离纯化大鼠胰岛可获得纯度高、活率高且活性好的大鼠胰岛细胞。; 陆忠沈水仙支涤静罗飞宏; 关键词：胰岛纯化

联合转染A20、HO—1基因对大鼠胰岛抗凋亡能力影响的研究被引量：4: 2013年; 目的研究A20基因、血红素加氧酶1基因（heineoxygenase1gene，110-1）转染在大鼠胰岛细胞中的表达情况及对体外培养条件下胰岛活性、拮抗放线菌酮（CHX）和肿瘤坏死因子．d（TNF—d）诱导的胰岛细胞凋亡作用的影响。方法构建A20、HO—J和增强绿色荧光蛋白（EGFP）慢病毒转移载体，荧光显微镜连续观察EGFP表达情况，评估转基因效率、确定诱导凋亡时机。Western印迹测定A20和HO-J蛋白表达。超敏ELISA试剂盒检测胰岛素浓度。胰岛经CHX＋TNF．仪处理48h进行TUNEL、流式细胞仪检测凋亡率。Western印迹检测半胱氨酸蛋白酶一3的活化。结果（1）分别以A20和HO．，慢病毒转染胰岛检测表明A20和HO—J蛋白均呈高表达。（2）胰岛细胞经培养48h和96h，转基因各组胰岛素浓度高于空白对照组（P〈0．01）。（3）CHX＋TNF-0【诱导胰岛细胞凋亡后，转A20组胰岛素浓度为（93．58±4．12）μg/ml、转110-J组胰岛素浓度为（88．98±4．77）μg／ml，联合转A20和HO-1，组胰岛素浓度（103．33±3．16）μg／ml，均高于转EGFP组[（9．03±0．65）Ixg／m1]和窄白对照组[（8．86±0．38）肌∥ml，P〈0．001]。Western印迹法检测显示联合转A20／HO-J基因组活化型半胱氨酸蛋白酶-3表达水平最低。结论原代胰岛细胞中高效表达的A20和HO—j蛋白具有抗CHX＋TNF—d诱导的胰岛凋亡作用，联合转A20和HO—J基因有协同抗凋亡效应。; 陆忠沈水仙支涤静徐虹郭礼和罗飞宏; 关键词：胰岛血红素加氧酶1 基因转染

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国家自然科学基金(30470808)

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