国家自然科学基金(30470773)
- 作品数：3 被引量：7H指数：2
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- RNA干扰CA916798基因真核表达载体的构建与鉴定被引量：4
- 2008年
- 目的构建CA916798基因RNA干扰(RNAi)的真核细胞表达载体。方法以CA916798为靶基因,以pGenSil-l质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的CA916798基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计2条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-l中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。用脂质体2000将重组质粒转染A549/CDDP细胞并用G418筛选,MTT法测定药物敏感性并绘制细胞增殖曲线。结果构建针对CA916798的pRNAi-CA916798shRNA,经限制性内切酶酶切、PCR和DNA测序证实与设计完全一致;在荧光显微镜下观察到A549/CDDP细胞表达绿色荧光蛋白(GFP)证实重组质粒己转染入细胞并用G418剔除了未转染质粒的细胞,1.0μg/ml顺铂作用后pRNAi-CA916798shRNA转染组细胞增殖受到明显抑制(P<0.01)。结论成功构建CA916798基因的shRNA表达载体,并筛选出转染了CA916798shRNA的A549/CDDP细胞。
- 王海晶杨和平周向东
- 关键词：RNA干扰真核表达载体转染
- MDR相关新基因CA916798真核表达载体的构建及其对H446细胞增殖的影响被引量：5
- 2007年
- 目的构建新基因CA916798真核表达载体,并观察其对H446增殖的影响。方法以人A549细胞总RNA为模板,用RT-PCR技术扩增获得CA916798开放阅读框序列,连接入pBluescriptⅡSK克隆载体上,将重组质粒转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,酶切与DNA测序鉴定准确,再用双酶切方法将CA916798开放阅读框序列定向连接到真核表达载体pQE-Trisystem中,构成pQE-Tri-CA916798,将pQE-Tri-CA916798转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确,脂质体转染人小细胞肺癌细胞系H446细胞,选取稳定转染不同质粒的H446细胞,采用MTT绘制细胞增殖曲线,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率。结果扩增出CA916798开放阅读框序列,大小约为350bp,重组质粒的酶切鉴定结果与预期一致,测序结果完全正确。转染了pQE-Tri-CA916798的H446细胞顺铂作用后增殖速度加快,凋亡率下降。结论成功构建了pQE-Tri-CA916798真核表达质粒,并初步证实了其与顺铂诱导的肺癌多药耐药相关。
- 王海晶杨和平周向东
- 关键词：H446细胞
- 肺腺癌耐药相关基因BC006151原核表达载体的构建及蛋白表达被引量：1
- 2008年
- 背景与目的肺癌细胞对化疗药物的耐受是肺癌患者生存率低的重要原因之一。我们在前期研究中发现了一条肺腺癌耐药相关的基因BC006151,本研究拟构建肺腺癌耐药相关基因的原核表达载体PGEX-4T-1-BC006151,诱导其表达及鉴定目的蛋白,从而揭示该基因与肺腺癌耐药的关系。方法以RNA为模板RT-PCR扩增,产物与质粒PGEX-4T-1用BamHI和EcoRI双酶切,用T4DNA连接酶将二者连接,连接物转化DH5α菌,重组克隆菌经测序鉴定确认。将带有目的片段的重组克隆载体转化BL21表达菌,SDS-PAGE电泳检测表达产物,Western blot检测GST融合蛋白表达。结果经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒中已插入了目的基因片段,与GenBank中公布的BC006151基因序列一致。重组克隆载体经BL21表达菌表达,获得40KD的条带(其中目的蛋白13KD,GST标签26KD)。结论成功构建了肺腺癌耐药相关基因BC006151原核表达载体,并成功诱导了目的蛋白表达,GST亲和纯化,为进一步制备该基因的多克隆、单克隆抗体奠定了基础。
- 李学军杨和平周向东
- 关键词：肺肿瘤基因载体基因表达
