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人截短型线粒体凋亡诱导因子蛋白的克隆、表达及诱导肝癌细胞凋亡的活性鉴定被引量：2: 2007年; 背景与目的:线粒体在细胞凋亡中扮演关键的角色,线粒体凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)是定位于线粒体中的一种重要的凋亡蛋白,对线粒体蛋白质的研究可深入阐明线粒体在凋亡中的作用。本研究的目的在于克隆、表达重组的人截短型AIF,并对其诱导肿瘤细胞核凋亡的生物学活性进行鉴定。方法:采用RT-PCR技术从人肝癌细胞SMMC-7721中扩增出剪切掉线粒体定位信号的人AIF基因片段,并按阅读框克隆到原核表达载体pET32a(+)中。进行酶切与测序鉴定后,以构建的正确重组质粒pET32a-AIF转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达AIF蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Western blot检测;采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白;采用凝胶滞后实验(EMSA)与Hoechst 33258染色检测AIF蛋白的生物学活性。结果:获得了去掉线粒体定位信号的AIF基因,并克隆到pET32a(+)载体中,经酶切与测序鉴定完全正确。此重组质粒转化入大肠杆菌,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中可表达相对分子质量约Mr70000的目的蛋白;表达量约占菌体蛋白总量的11%,表达的目的蛋白与抗His标签抗体与抗人的AIF蛋白具有良好的反应性;纯化后,AIF的纯度达到95%。经EMSA与Hoechst 33258染色实验证实:获得的AIF蛋白具有良好地与DNA结合并可诱导肿瘤细胞核凋亡的能力,凋亡率为37%。结论:人AIF基因在PET表达系统中得到有效表达;蛋白复性后能有效地在体外与DNA结合,并可诱导细胞凋亡。; 付玉荣伊正君颜玉蓉邱宗荫; 关键词：SMMC-7721细胞凋亡诱导因子蛋白质纯化

HCPT诱导肝癌细胞凋亡时AIF定位变化与DNA的损伤: 2007年; 目的:探讨羟基喜树碱(HCPT)诱导SMMC-7721细胞凋亡过程中凋亡诱导因子(AIF)不同时相的定位变化和DNA损伤的关系。方法:HCPT作用SMMC-7721细胞后在不同时间点收集细胞,用细胞组分分离试剂盒分离细胞质、线粒体与细胞核成分,用蛋白印迹法与共聚焦显微镜观察AIF的转位,用TUNEL法检测DNA损伤。结果:蛋白印迹结果显示线粒体中AIF在HCPT作用1h无明显变化,6h出现了明显转位,在12h与24h更明显;共聚焦结果也显示在HCPT作用6h后,AIF已从线粒体迁出,12h与24h后,大部分AIF已从线粒体迁至细胞核;TUNEL法检测结果表明伴随AIF的核迁移,DNA出现了明显的损伤。结论:HCPT作用SMMC-7721细胞后AIF的释放是凋亡的早期改变之一;伴随AIF的核转位,同时出现了DNA损伤。; 付玉荣伊正君颜玉蓉邱宗荫; 关键词：生物碱类凋亡诱导因子细胞凋亡

羟基喜树碱诱导肝癌细胞凋亡前后线粒体疏水蛋白质组的定量分析被引量：3: 2008年; 抗癌剂羟基喜树碱可以通过线粒体途径诱导肝癌细胞凋亡.应用定量蛋白质组学技术分析羟基喜树碱诱导肝癌细胞凋亡前后的线粒体疏水蛋白质差异表达,探讨癌细胞凋亡机制及羟基喜树碱的抗癌机理.分离提取羟基喜树碱诱导肝癌细胞凋亡前后的线粒体,并采用顺序抽提法提取疏水蛋白质;用含稳定同位素亲和标签的c-ICAT试剂标记蛋白,利用基于多维色谱-线性离子阱/静电场轨道阱质谱联用技术的鸟枪(shotgun)法策略分析鉴定了在肝癌细胞凋亡前后的线粒体中表达量差异有显著统计学意义(P<0·05)的疏水蛋白144种,其中,12种蛋白的表达量在凋亡细胞中下调,而表达量在羟基喜树碱诱导细胞凋亡后上调10倍以上的蛋白43种.这些蛋白主要与细胞分裂增殖、分化凋亡、能量代谢、核酸代谢以及信号转导相关.该研究结果为在亚细胞定量蛋白质组水平上深入探讨羟基喜树碱的作用机理提供了新的实验依据,亦为研究肿瘤细胞凋亡机制提供了新的思路.; 颜玉蓉付玉荣王伟佳邱宗荫; 关键词：线粒体羟基喜树碱

羟基喜树碱诱导肝癌细胞凋亡前后线粒体蛋白质组表达差异的定量分析被引量：2: 2008年; 目的对羟基喜树碱诱导人肝癌细胞SMMC7721凋亡前后的线粒体进行定量蛋白质组学研究。方法用羟基喜树碱诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡，提取线粒体并鉴定其纯度；用可裂解的同位素标记的亲和标签技术标记线粒体蛋白质，利用二维液相色谱-串联质谱分析鉴定蛋白质。结果获得了羟基喜树碱诱导细胞凋亡前后的高纯度线粒体；分析鉴定了细胞凋亡前后，相对表达量差异有统计学意义的蛋白质74种，其中42种线粒体蛋白质在细胞凋亡后的表达量下调，32种蛋白质的表达量在凋亡细胞中上调。这些差异蛋白的分子功能主要表现为能量代谢和核酸的翻译、转录、复制以及细胞骨架等。结论获得了羟基喜树碱诱导肝癌细胞凋亡前后的线粒体差异蛋白信息，将促进对癌细胞凋亡机制及羟基喜树碱药理作用的深入理解，同时，实验所采用的整合技术平台将有助于亚细胞定量蛋白质组学研究。; 颜玉蓉付玉荣邱宗荫; 关键词：喜树碱线粒体质谱

羟基喜树碱通过线粒体途径诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的观察被引量：15: 2006年; 目的:研究羟基喜树碱是否可通过线粒体途径诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡.方法:将不同浓度的羟基喜树碱作用于肝癌细胞SMMC-7721,用MTT法检测细胞增殖,光镜观察细胞形态;用荧光染料MitocaptureTM检测线粒体跨膜电位、用Western blot法检测细胞色素C从线粒体的释放;用AnnexinⅤ-FITC,hoechst法及电镜检测细胞的凋亡状况.结果:羟基喜树碱对肝癌细胞SMMC-7721的增殖有明显的抑制作用,IC50约是80 mg/L.当用80 mg/L羟基喜树碱作用不同时间后:线粒体膜跨电位下降并伴随有细胞色素C从线粒体至细胞质的释放;细胞膜的磷脂酰丝氨酸外翻;细胞核染色质固缩,呈致密浓染的凋亡状态.结论:羟基喜树碱通过线粒体途径引起线粒体跨膜电位下降与细胞色素C的释放可能是其诱导肿瘤细胞凋亡的途径之一.; 付玉荣邱宗荫颜玉蓉; 关键词：羟基喜树碱线粒体细胞色素C

羟基喜树碱诱导SMMC-7721细胞凋亡时线粒体凋亡诱导因子的转位研究被引量：9: 2006年; 目的研究羟基喜树碱诱导肝癌细胞株SMMC-7721凋亡时线粒体凋亡相关蛋白凋亡诱导因子表达及从线粒体发生核转位的变化。方法用80μ／ml羟基喜树碱作用于肝癌细胞株SMMC-7721后, 用吖啶橙／溴化乙啶染色法观察细胞凋亡现象;用电子显微镜观察线粒体超微结构;分别用逆转录聚合酶链反应、Western blot检测凋亡诱导因子在mRNA与蛋白质水平表达的变化;用激光共聚焦显微镜观察凋亡诱导因子在细胞凋亡时从线粒体到核的迁移变化。结果 80μg／ml羟基喜树碱作用SMMC-7721细胞后, 吖啶橙／溴化乙啶荧光双重染色可见细胞体积缩小、细胞皱缩、核碎裂等典型细胞凋亡形态学改变;超微结构观察发现线粒体肿胀;细胞凋亡时凋亡诱导因子在m R N A与蛋白质水平上的表达与对照组细胞相比没有明显变化,但凋亡诱导因子发生了从线粒体到核的迁移。结论羟基喜树碱可以通过线粒体途径诱导人肝癌细胞发生凋亡;在线粒体凋亡途径中,线粒体凋亡相关蛋白凋亡诱导因子从线粒体释放并发生核转位可能与羟基喜树碱诱导细胞凋亡密切相关。; 付玉荣邱宗荫颜玉蓉; 关键词：喜树碱细胞凋亡线粒体凋亡诱导因子

羟基喜树碱诱导SMMC-7721细胞线粒体跨膜电位耗散的蛋白质组分析被引量：2: 2007年; 目的比较蛋白质组,分析羟基喜树碱诱导肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡前后的线粒体蛋白质表达谱。方法用羟基喜树碱诱导肝癌SMMC-7721细胞发生线粒体跨膜电位耗散,提取线粒体并用Western blot法对线粒体纯度进行鉴定；用二维凝胶电泳分离溶解度不同的3种蛋白质组分并对蛋白质进行银染色；利用PDQuest图像分析软件分析比较凝胶结果,获得差异蛋白质；采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴定部分差异蛋白质,并用Western blot法对部分差异蛋白质进行进一步的鉴定。结果羟基喜树碱成功地诱导线粒体发生跨膜电位耗散,并获得纯度很高的线粒体；通过PDQuest图像分析软件发现,线粒体发生跨膜电位耗散前后比较约有39个蛋白质点表达有差异,对其中28个差异蛋白质斑点进行了肽质指纹图分析,鉴定出20种可能的蛋白质。结论获得了羟基喜树碱诱导线粒体凋亡前后差异蛋白的相关信息,为从蛋白质水平进一步研究羟基喜树碱诱导癌细胞发生凋亡的机制奠定了基础。; 付玉荣伊正君颜玉蓉邱宗荫; 关键词：喜树碱质谱分析

羟基喜树碱诱导肝癌细胞凋亡前后细胞核蛋白质组变化的定量分析被引量：5: 2008年; 对羟基喜树碱诱导肝癌细胞凋亡前后的细胞核蛋白质组进行定量研究,获得凋亡前后细胞核蛋白质组中差异蛋白表达量相对变化的信息,为在亚细胞定量蛋白质组水平上深入探讨羟基喜树碱的作用机理提供实验依据。分离提取羟基喜树碱诱导肝癌细胞凋亡前后的细胞核并鉴定其纯度,用含稳定同位素的化学试剂c-ICAT标记细胞凋亡前后的细胞核蛋白,对细胞核标记蛋白进行消化和纯化,利用基于多维色谱-线性离子阱/静电场轨道阱质谱联用技术的鸟枪(Shotgun)法策略及c-ICAT定量策略分析鉴定蛋白质,获得同一种肝癌细胞核蛋白质在凋亡前后细胞中的表达量变化比值。分析鉴定了在细胞凋亡前后的表达量差异有显著统计学意义(P<0.05)的肝癌细胞核蛋白42个,其中,12个蛋白的表达量在羟基喜树碱诱导细胞凋亡后下调,30个蛋白的表达量在凋亡细胞中上调。这些差异蛋白的分子功能主要与细胞增殖、凋亡和分化、能量代谢、核酸代谢以及细胞骨架相关。; 颜玉蓉付玉荣邱宗荫; 关键词：10-羟基喜树碱细胞凋亡定量蛋白质组学

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国家自然科学基金(30470786)

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