国家自然科学基金(30873017)
- 作品数：9 被引量：19H指数：3
- 相关作者：汤华刘民李欣汤石明吴海东更多>>
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- 翻译控制肿瘤蛋白TPT1的原核表达、纯化、抗体制备和初步应用被引量：7
- 2010年
- 目的:原核表达并纯化翻译控制蛋白TPT1,免疫日本大耳白兔制备其抗体。方法:构建原核表达质粒pRSE-TA2-TPT1,转化大肠杆菌BL21(DE3),TPT1蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。融合蛋白通过Ni-NTA树脂亲和纯化后免疫兔子制备抗体血清。以间接ELISA法检测抗体效价,Western blot和免疫荧光染色鉴定抗体特异性。结果:在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的TPT1融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫大白兔,获得了高特异性的抗TPT1抗血清。结论:成功构建原核表达质粒pRSETA2-TPT1,表达并纯化TPT1蛋白,制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体.为进一步研究TPT1在肿瘤等疾病发生、发展过程及治疗中的作用奠定基础。
- 赵一璠李海芳汤石明王萌吴海东刘民李欣汤华
- 关键词：原核表达纯化抗体肿瘤
- 人Argonaute2蛋白多克隆抗体制备及初步应用被引量：2
- 2010年
- 目的:制备人Argonaute2(Ago2)的多克隆抗体,鉴定其特异性,并应用该抗体检测Ago2在人各细胞系中的表达差异及细胞定位。方法:用DNAstar软件寻找抗原性高的Ago2序列区域(命名为k-Ago2),构建k-Ago2的表达质粒,转化大肠杆菌并诱导表达。融合蛋白经切胶回收纯化后免疫大白兔制备抗体。以ELISA检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性及检测Ago2在细胞系中的表达差异,免疫荧光染色观察Ago2的细胞定位。结果:成功构建表达质粒,继而k-Ago2得以表达与纯化,免疫大白兔后得到Ago2多克隆抗体。ELISA检测抗体效价为1∶19 000,Western blot确定抗体具有高度特异性,并成功地用该抗体检测到Ago2在人各细胞系中的表达差异及细胞定位。结论:Ago2多克隆抗体的成功制备,对RNAi机制的深入研究及其进一步的临床应用均具有重要价值。
- 李海芳浦永汤石明强冉汤华
- 关键词：多克隆抗体RNA干扰
- PIWIL4的克隆及其抗体制备和初步应用
- 2010年
- 目的制备兔抗人PIWIL4的多克隆抗体，鉴定其特异性，并应用该抗体检测内源性PIWIL4在人各细胞系中的表达差异及细胞定位。方法构建原核表达质粒pGEX-5X-1．PIWIL4，转化大肠杆菌BL21，PIWIL4蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。融合蛋白通过切胶纯化后免疫家兔制备抗体血清。以间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗体效价，Westernblot鉴定抗体特异性及检测PIWIL4在各细胞系中的表达差异，免疫荧光染色观察PIWIL4的细胞定位。结果成功构建原核表达质粒，表达并纯化PIWIL4蛋白。免疫大白兔后得到PIWIL4多克隆抗体，ELISA检测抗体效价为1：20000，Westernblot和免疫组化确定抗体具有高度特异性，并成功地应用该抗体检测到PIWIL4在人多种细胞系中的表达差异及细胞定位。结论PIWIL4蛋白及其多克隆抗体的成功制备，为进一步研究PIWIL4的生物学功能奠定了基础。
- 苏畅浦永孔鹏洲王萌刘民汤华
- 关键词：原核表达抗体肿瘤
- MicroRNA-17-5p反义寡核苷酸阻滞白血病K562细胞的细胞周期
- 2010年
- 目的:以反义寡核苷酸技术研究microRNA-17-5p(miR-17-5p)对人慢性髓系白血病K562细胞增殖的影响及其可能的机制。方法:脂质体法将miR-17-5p反义寡核苷酸(miR-17-5p antisense oligonucleotide,miR-17-5p-ASO)和对照无义寡核苷酸(control nonsense oligonucleotide,Ctrl-NSO)转染入K562细胞,同时设未转染对照组(Ctrl)。MTT法检测K562细胞的增殖,TUNEL法检测K562细胞的凋亡,流式细胞术检测K562细胞周期的改变。结果:MTT检测结果显示,miR-17-5p-ASO组K562细胞增殖活性为Ctrl-NSO组的(61.7±4.7)%,miR-17-5p-ASO转染显著抑制K562细胞的增殖(P<0.05)。TUNEL检测显示,miR-17-5p-ASO转染不影响K562细胞凋亡(P>0.05);miR-17-5p-ASO组K562细胞G2期细胞比例为(10.8±0.8)%,显著低于Ctrl-NSO组和Ctrl组的(34.6±0.4)%和(33.9±1.3)%(P<0.05)。结论:MiR-17-5p反义寡核苷酸可以通过调控细胞周期抑制K562细胞的增殖,有望成为白血病治疗的新手段。
- 马卓娅李欣汤华刘民
- 关键词：反义寡核苷酸白血病K562细胞细胞周期
- RNA干扰抑制癌胚抗原表达对结肠癌细胞增殖的影响被引量：4
- 2009年
- 癌胚抗原(CEA)作为肿瘤标志物,在多种恶性肿瘤中高表达.为探索CEA在肿瘤发生发展过程中的生物学作用,本研究以结肠癌细胞株8307为研究对象,应用RNAi技术抑制CEA在8307细胞中的表达,观察其对8307细胞生长的影响.依据siRNA设计原则,设计合成靶向CEA的shRNA并克隆到pSilencer2.1-U6 neo载体中,成功构建了CEA shRNA表达载体,通过脂质体介导转染8307细胞,经G418筛选出抑制CEA表达的稳定细胞.RT-PCR、Western印迹分别检测CEA mRNA及蛋白表达水平,MTT及集落形成实验检测细胞增殖活性.实验结果显示,构建的CEA shRNA表达载体明显抑制CEA mRNA及蛋白水平的表达.MTT实验中,CEA表达下调的8307细胞生长活性降低,与对照组相比,抑制率达39%(P<0.05),细胞集落形成能力也显著降低(P<0.05).上述结果初步证明,构建的CEA shRNA表达载体能明显降低CEA的表达,并抑制结肠癌细胞增殖活性.
- 崔欲晓刘民李欣汤华
- 关键词：癌胚抗原RNA干扰SHRNA结肠癌
- RNA干扰敲减PIWIL1表达对人结肠癌细胞SW620增殖,粘附及侵袭能力影响被引量：1
- 2010年
- PIWIL1为AGO蛋白(Argonaute proteins)PIWI亚家族的成员之一,在睾丸中特异表达.其在干细胞自我更新、RNA干扰和翻译调节中起着重要的作用.本文采用实时PCR方法检测PIWI基因家族中PIWIL1、PIWIL2、PIWIL3、PIWIL4在人结肠癌SW620细胞中mRNA表达水平,首次证实了在SW620细胞中,PIWIL1相对PIWIL2、PIWIL3、PIWIL4,其表达水平最高(P(0.05).构建表达针对PIWIL1的小发卡结构干扰RNA的重组质粒,并用Western印迹验证其达到较高的干扰效率.用脂质体将重组质粒转染入SW620细胞中,通过MTT实验、集落形成实验、细胞聚集实验及细胞侵袭转移实验,分别观察到其可抑制SW620细胞的生长、增殖、侵袭转移能力,增强了SW620细胞的粘附能力.提示PIWIL1可能在结肠癌发生、发展过程中发挥作用.
- 任超逸吴海东浦永汤石明李欣刘民汤华
- 关键词：结肠癌SW620细胞RNA干扰
- 纤维连接蛋白1的原核表达、纯化及抗体的制备
- 2010年
- 目的构建人纤维连接蛋白1（FN1）基因的原核表达载体，诱导其表达并纯化该蛋白，制备特异性抗体。方法利用RT—PCR方法扩增人FN1编码序列450bp的片段，包含FN1羧基端的150个氨基酸。构建原核表达质粒pRSETA2-FN1，转化大肠杆菌BL21（DE3），FN1蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。融合蛋白通过Ni^2＋-NTA树脂亲和纯化后免疫兔制备抗体血清。蛋白质免疫印迹（Western blot）和免疫组化检测其特异性。结果成功构建重组质粒pRSETA2-FN1，限制性内切酶酶切鉴定及DNA测序均显示插入片段正确。SDS—PAGE凝胶显示表达的融合蛋白相对分子质量约为20000（FN1-His标签），与预期结果一致。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗体效价约为1：10000，Western blot显示可以特异性地检测出人血浆和肝癌细胞系HepG2全细胞裂解液中相对分子质量约250000的纤维连接蛋白。免疫组织化学可显示FN1在正常肺及肺癌组织中的特异性分布。结论成功地原核表达了FN1C-末端蛋白，并免疫获得了抗FN1特异性抗体。
- 王菲菲苏畅吴海东王萌孔鹏洲刘民李欣汤华
- 关键词：纤维连接蛋白基因表达抗体癌症
- 基于哺乳动物单杂交技术ERα调节剂高通量筛选模型的建立及应用被引量：1
- 2009年
- 雌激素受体α(Estrogen receptor α,ERα)是一种类固醇核受体,在机体的多种生理功能中起关键作用。为了筛选新的ERα调节剂,本研究建立一个基于哺乳动物单杂交的报告基因技术的高通量ERα调节剂筛选模型。利用RT-PCR技术从脂肪组织总RNA中扩增ERα配体结合区(Ligand binding domain,ERαLBD)基因序列,并插入含GAL4DNA结合域的pBIND-GAL4表达质粒构建pBIND-GAL4-ERα(LBD)的嵌合表达质粒。该质粒与本室已构建好的含GAL4响应元件和荧光素酶的报告质粒pGL3-GAL4共转染,通过测定荧光素酶的活性评价ER调节剂的转录调剂的活性。经过多种条件优化,激动剂阳性药对照雌二醇可以剂量依赖地诱导荧光素酶的表达,最大上调倍增数可达28.1倍,EC50为0.17μmol/L。拮抗剂阳性对照它莫昔芬可以有效地拮抗雌二醇的活性,最大下调倍数为6.3倍,EC50为0.1μmol/L。该筛选模型可微量化于384孔板,且Z'因子均大于0.5。利用该模型从2000多个微生物和植物来源的天然产物以及合成化合物中筛选得到4个ERα激动剂。该模型灵敏、稳定,可以快速进行多种来源的ERα调节剂的筛选和活性评价。
- 张倩水小溪范玉玲郝伟丽郑智慧路新华赵宝华张华贺建功
- 关键词：ERΑ激动剂拮抗剂共转染高通量筛选
- 人DFF45蛋白多克隆抗体制备及其初步应用被引量：4
- 2010年
- 目的:表达、纯化带GST标签的DNA裂解因子45(DNA fragmentation factor 45,DFF45)融合蛋白并制备多克隆抗体。方法:构建pGEX-5X-1/DFF45原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导融合蛋白表达,经纯化后免疫日本大耳白兔得到多克隆抗体并用CNBr-activatedSepharoseTM4B进行纯化。用间接ELISA法检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性,同时用免疫荧光染色鉴定抗体特异性并观察DFF45的细胞定位。进一步检测DFF45在人类几种细胞系的表达差异情况。结果:成功构建原核表达质粒,表达、纯化DFF45蛋白并免疫动物后得到多克隆抗体。间接ELISA法显示抗体效价达1∶20 000,Western blot确定抗体具有高度特异性。应用该抗体检测发现DFF45在人类几种细胞系中表达存在差异并观察到其细胞定位。结论:DFF45多克隆抗体的成功制备及其在人类细胞系的差异表达,为进一步研究DFF45基因与肿瘤及其相关疾病的关系奠定了基础。
- 孔卫青李海芳刘涛吴海东强冉汤石明刘民汤华
- 关键词：DFF45融合蛋白多克隆抗体
