国家科技重大专项(2001BA804A48)
- 作品数：6 被引量：57H指数：3
- 相关作者：董俊杨云庆周晓黎花群义钟金栋更多>>
- 相关机构：云南出入境检验检疫局云南农业大学昆明理工大学更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 非洲猪瘟病毒VP73基因克隆及在大肠杆菌中的高效表达被引量：5
- 2006年
- 参照Genebank中非洲猪瘟VP73基因序列,人工合成的VP73全基因克隆至pMD18-T克隆载体质粒中,采用PCR扩增得到1188bp的VP73基因;将VP73基因片段亚克隆插入pBAD/Thio表达载体,经测序鉴定,筛选获得VP73基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了非洲猪瘟病毒VP73基因重组表达载体。经L-Arabinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP73蛋白抗原。SDS-PAGE结果表明,以终浓度为0.002%的L-Arabinose进行诱导,4h后表达量最高,表达蛋白为融合蛋白,分子量约60kDa,表达产量约占菌体总蛋白的30%。Western blotting和ELISA检测表明,表达的融合蛋白能与非洲猪瘟阳性血清发生特异性反应,说明表达获得的产物为非洲猪瘟病毒VP73融合蛋白,且具有良好的反应原性,这为应用该表达蛋白抗原制备ASFV免疫血清学诊断试剂和疫苗研究奠定了基础。
- 常华花群义段纲杨云庆周晓黎董俊尹尚莲项勋曾昭文
- 关键词：非洲猪瘟病毒克隆
- 实时荧光定量RT-PCR检测猪水疱病病毒的研究被引量：3
- 2006年
- 按照猪水疱病病毒结构蛋白VP1基因序列,设计合成引物和探针,经各反应条件的优化,建立了实时荧光定量RT-PCR技术,对猪水疱病病毒进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,实时荧光TaqManRT-PCR可检测到每个反应相当于1×102拷贝病毒RNA;与FMDV、VSV等其他水疱性病毒不发生交叉反应;制作的标准曲线中各浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽,相关系数为0.993;与常规的RT-PCR比较,该方法具有快速、特异、敏感、重复性好、可同时检测大量样品等优点。
- 钟金栋花群义肖荣海夏雪山杨云庆周晓黎董俊邓祖洪
- 关键词：猪水疱病病毒聚合酶链反应
- 小反刍兽疫病毒H糖蛋白基因原核表达载体的构建及表达被引量：12
- 2006年
- 参照GenBank中小反刍兽疫病毒(PPRV)H抗原基因序列,人工合成了PPRV H基因,将其克隆至pUC18-T质粒中,转化E.coliJM109感受态细胞,构建并选择PPRV H基因克隆重组质粒,经核苷酸序列分析正确,将其克隆至pBAD/Thio-TOPO载体中,转化E.coliTOP10感受态细胞,核苷酸序列分析证实,成功构建了PPRV H基因重组表达载体。经不同浓度L-阿拉伯糖诱导,可稳定、高效地表达PPRV H抗原。SDS-PAGE分析结果表明,用终浓度为0.2 g/L的L-阿拉伯糖诱导5 h的表达量最高,表达蛋白为分子质量约83 ku的融合蛋白;经薄层扫描分析,其表达产量约占菌体总蛋白的10%。Western-blotting检测表明,诱导的蛋白能与PPRV H蛋白单抗发生特异性反应,说明表达的融合蛋白中含有PPRV H糖蛋白抗原。
- 刘玉洪花群义徐自忠杨云庆周晓黎董俊尹尚莲许靖逸高洪
- 关键词：小反刍兽疫病毒
- 小反刍兽疫病毒分子生物学研究进展被引量：39
- 2006年
- 小反刍兽疫是一种急性、热性、接触性传染病,是世界动物卫生组织规定的A类传染病,在我国被列为一类动物疫病,具有高发病率和高死亡率等特点。该病给小反刍动物养殖及国家和外贸经济带来了巨大的损失。文章主要叙述了小反刍兽疫病毒各基因结构特点,6种结构蛋白的功能,小反刍兽疫的诊断技术等方面的最新研究进展。
- 刘玉洪徐自忠花群义高洪许靖逸
- 关键词：小反刍兽疫基因蛋白分子生物学特性
- 猪水泡病病毒VP1基因的克隆和表达被引量：1
- 2006年
- 以猪水泡病病毒RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了849bp的VP1基因,通过T-A克隆技术,将VP1基因片段克隆至pMD18-T克隆载体质粒中,构建SVDVVP1基因克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析。然后亚克隆插入pBAD/ThioTOPO表达载体,经测序鉴定,筛选获得VP1基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了猪水泡病病毒VP1基因重组表达载体。经L-Arabinose诱导表达,可稳定、高效地表达VP1蛋白抗原。SDS-PAGE结果表明,以终浓度为0.002%的L-阿拉伯醛糖进行诱导,5h后表达可达到高峰,表达蛋白为融合蛋白,质量约47.13kDa,表达产量约占菌体总蛋白的16%。Westernblotting检测表明,诱导的蛋白能与猪水泡病阳性血清发生特异性反应。融合蛋白中含有猪水泡病病毒VP1蛋白抗原,为应用该表达蛋白抗原制备SVD免疫血清学诊断试剂和新型疫苗构建奠定基础。
- 钟金栋花群义肖荣海夏雪山杨云庆周晓黎董俊邓祖洪
- 关键词：猪水泡病病毒VP1克隆
- 猪水泡病病毒RT-PCR检测方法的建立被引量：2
- 2006年
- 根据基因库中的猪水泡病病毒(SVDV)高度保守的VP1基因的序列,设计了与SVDV互补的2对特异性引物,通过对影响PCR扩增因素的筛选,成功地扩增出251bp和366bp特异性条带,将其克隆入pMD18-T载体中,并进行序列测定,与已发表的SVDV基因比较发现,核苷酸的同源性为100%,证实为SVDV的VP1段基因。通过检测FMDV、VSV、BHK21细胞等,对照的扩增结果均为阴性,验证其特异。对SVDVRNA进行10倍系列稀释后检测,结果SVDVRNA在10-4稀释度时仍能检测到阳性,说明具有较好的敏感性。此项试验能稳定、高效、快速地检测出猪水泡病病毒。
- 钟金栋花群义夏雪山杨云庆周晓黎董俊
- 关键词：猪水泡病病毒RT-PCR
