国家自然科学基金(30660166)
- 作品数：6 被引量：15H指数：2
- 相关作者：崔玉宝周鹰彭江龙孙炜王颖更多>>
- 相关机构：盐城卫生职业技术学院海南医学院中国热带农业科学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金盐城市科技发展计划项目海南省卫生厅科研基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 粉尘螨变应原第2组分基因的原核表达及生物信息学分析被引量：2
- 2011年
- 目的:克隆并原核表达粉尘螨变应原第2组分重组蛋白,鉴定其变应原性,分析其分子特征,为制备用于临床诊治的变应原奠定基础。方法:提取粉尘螨Total RNA,根据国际基因库(AB195580)设计并合成引物,经RT-PCR合成Derf 2全长基因,与pMD19-T载体连接后,热转化至E.coliJM109;将测序正确的Der f 2基因与pET28a(+)Vector连接,转化BL21(DE3),IPTG诱导表达;经镍琼脂糖凝胶FF亲和柱层析,收集各阶段洗脱峰用梯度透析法进行复性,Western blot鉴定重组蛋白的变应原性。用生物信息学软件预测其理化性质、空间结构,并构建分子进化树。结果:RT-PCR成功扩增获得目的基因Der f2,全长441 bp,与参考序列同源性99.3%。将构建的pET28a(+)-Der f 2质粒转化宿主菌E.coliBL21诱导表达,SDS-PAGE电泳显示全细胞和沉淀物中均有蛋白表达。亲和柱层析后获得约3.86 mg重组蛋白纯品,Western blot分析表明其可与哮喘患儿血清IgE发生特异性结合。去除信号肽序列(1～17氨基酸)后,重组蛋白由129个氨基酸组成,相对分子质量为14.076,二级结构由延伸主链(30.82%),无规则卷曲(49.32%),α螺旋(19.86%)组成。该变应原可能位于线粒体,属ML域家族。序列比对显示,粉尘螨和屋尘螨、微角尘螨、梅氏嗜霉螨的相似度依次为88%、96%、83%,此四种螨在上述蜱螨变应原第2组分构建的分子进化树中聚成一簇,支持率达100%。结论:粉尘螨变应原第2组分原核表达获得成功,纯化后获得具有变应原性的重组蛋白,为进一步规模生产该变应原并用于临床诊治奠定基础;生物信息学分析初步获得了该变应原的分子特征,为进一步实验室验证指明方向。
- 胡友莹周鹰杨李王运刚崔玉宝
- 关键词：粉尘螨变应原原核表达生物信息学
- 粉尘螨变应原第5组分基因克隆及分子特征分析
- 2009年
- 目的获得粉尘螨变应原第5组分的编码基因（Derf5）并了解其分子特征。方法用RNAiso试剂盒提取粉尘螨总RNA，根据GenBank已公布的Derf5核酸序列设计引物，用RT—PCR扩增获得其编码基因，插入pMD19-T Simple载体进行序列测定和分析。结果获得的Derf5基因与参考序列（GenBank AY283283）同源件达97．8％，含1个完整的开放阅读框架（ORF），由132个氨基酸组成，信号肽位于1～19AA、跨膜Ⅸ域位于1-19AA，为细胞外疏水性蛋白。二缴结构由延伸主链（1．52％）、无规则卷曲（7．58％）和α螺旋（90．91％）组成。具有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点2个。其氨基酸序列与屋尘螨变应原第5组分相似率为78％。结论成功克隆了Der f5，并初步预测得其分子特征。
- 崔玉宝彭江龙周鹰王颖孙炜
- 关键词：粉尘螨变应原生物信息学
- 球形芽胞杆菌S层蛋白基因的克隆及原核表达
- 2012年
- 目的克隆球形芽胞杆菌S层蛋白的编码基因,实现其原核表达并纯化表达产物。方法提取球形芽胞杆菌菌体基因组DNA,根据GenBank公布的核酸序列设计并合成引物,扩增S层蛋白编码基因sllB,与pMD19-T载体连接;测序验证后,构建原核表达质粒pET28a(+)-sllB并转化BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS-PAG和Westernblot鉴定表达产物,亲和柱层析纯化重组蛋白。结果扩增获得S层蛋白编码基因sllB全长(3 306bp),与参考序列同源性为97.5%。构建的原核表达质粒pET28a(+)-sllB转化BL21(DE3)后,SDS-PAGE显示表达蛋白的分子质量为116ku,与理论值相符。Western blot显示其全蛋白、可溶性蛋白和不溶性蛋白中均被鼠抗Penta-His抗体识别。结论获得了球形芽胞杆菌S层蛋白编码基因sllB,并实现了其原核表达。
- 杨李周鹰王运刚马桂芳崔玉宝
- 关键词：基因克隆
- 粉尘螨变应原第6组分全长cDNA克隆及生物信息学分析被引量：2
- 2009年
- 目的:获得粉尘螨变应原第6组分编码基因并了解其分子特征。方法:根据GeneBank已公布的Derf6核酸序列设计引物,用RT-PCR扩增获得其编码基因,插入pMD19-T载体进行序列测定和生物信息学分析。结果:获得的Der f6 cD-NA全长为840 bp,与参考序列同源性达96.8%,含1个完整的开放读码框。推测编码蛋白由279个氨基酸组成,信号肽序列位于1～19 aa,亲水性指数为-0.139,跨膜区域位于1～19 aa,二级结构由α-螺旋(7.17%)、延伸主链(36.56%)和无规卷曲(56.27%)组成;亚细胞定位于细胞外,N-端第6位和第11位的亮氨酸有明显的序列核输出信号;可能为糜蛋白酶,具有cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N端酰基化位点等。结论:获得了Derf6基因全长,其编码的细胞外疏水性蛋白可能具有糜蛋白酶活性。
- 崔玉宝周鹰彭江龙孙炜王颖
- 关键词：粉尘螨变应原生物信息学
- 尘螨变应原Der f 2基因克隆及序列分析被引量：9
- 2008年
- 目的:获得尘螨变应原Derf2基因及其生物信息学资料.方法:提取粉尘螨总RNA,RT-PCR合成Derf2的cDNA片段,回收PCR产物并连接至pMD19-Tsimple,经测序验证后亚克隆入表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌感受态细胞后提取质粒,双酶切鉴定.用ExPaSy,EBI,NCBI网站的在线软件对测序结果进行分析.结果:RT-PCR扩增获得了Derf2cDNA片段,酶切、电泳结果表明克隆和亚克隆获得成功.与参考序列相比,测序结果多了87bp(77～163),但Blastn发现中国广州和德国Reinbek报道的序列中也含此87bp.同源性、相似性、序列比对及分子进化分析提示,该序列与中国广州和德国Reinbek报道的序列亲缘关系较近.推测该变应原由176个氨基酸组成,与附睾分泌蛋白E1具有同源性,信号肽位于1～17aa处,在6～24aa处有一跨膜螺旋.二级结构由a-螺旋(16.57%),延伸链(32.57%)和随机卷曲(50.86%)组成.结论:获得了粉尘螨变应原Derf2编码基因及其分子特征,为进一步生产基因工程变应原用于临床诊治变态反应性疾病奠定了基础.
- 崔玉宝周鹏彭明周鹰彭江龙
- 关键词：粉尘螨F变应原
- 3种常见尘螨分子进化关系的初步探讨被引量：4
- 2008年
- 为探讨粉尘螨(Dermatophagoides farinae)、屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)和梅氏嗜霉螨(Euroglyphus maynei)的分类,采用PCR扩增获得粉尘螨1类(Derf1)和2类变应原(Derf2)的cDNA片段,经测序后推导氨基酸序列,与GenBank中的屋尘螨Derp1、Derp2和梅氏嗜霉螨Eurm1、Eurm2氨基酸序列进行比对,分别构建1类和2类变应原分子进化树。结果显示变应原之间相似度,Derp1与Eurm1为86%,Derp1与Derf1为83%;Derp2与Eurm2为87%,Derp2与Derf2为67%。用变应原氨基酸序列构建分子进化树,1类变应原Derp1与Eurm1聚成一簇,2类变应原Derp2与Eurm2聚成一簇。结果表明屋尘螨和梅氏嗜霉螨亲缘关系较近,而与粉尘螨较远。
- 崔玉宝高璀乡周鹰彭江龙刘良
- 关键词：粉尘螨屋尘螨分子进化
