南京医科大学科技发展基金(NMUZ009)
- 作品数：3 被引量：2H指数：1
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- 相关机构：南京医科大学江苏省人民医院更多>>
- 发文基金：南京医科大学科技发展基金国家自然科学基金教育部“新世纪优秀人才支持计划”更多>>
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- 靶向PCSK9基因shRNA慢病毒载体的构建及其对PCSK9基因表达的沉默
- 2009年
- 目的设计以PCSK9基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒载体并鉴定此RNA干扰体系对PCSK9基因表达的影响。方法将3条人PCSK9基因的shRNA片段插入至慢病毒载体pLentilox3.7,与pCDNA3-hPCSK9-FLAG质粒用Lipofectamine2000共转染293细胞,Westernblotting法鉴定出最有效的shRNA。此重组质粒与pCre-VSV-G、pLoxp-CMV-R8.91经293细胞包装后,产生的重组慢病毒感染293细胞,48h后转染pCDNA3-hPCSK9-FLAG质粒,Western blotting法检测人PCSK9基因表达的情况。结果经双酶切鉴定,构建了PCSK9 shRNA慢病毒载体pLentilox-hPC-SK9,鉴定出hshRNA-2为最有效的shRNA。重组的慢病毒能明显的抑制人PCSK9的表达。结论慢病毒介导的shRNA干扰技术可特异性的阻断PCSK9的表达,为进一步探讨PCSK9特异性的shRNA治疗脂代谢异常疾病奠定了基础。
- 陈云孙倍成刘根焰王芳
- 关键词：PCSK9慢病毒
- 人膜连蛋白A2基因重组慢病毒载体的构建及其在肝癌细胞株中的表达
- 2011年
- 目的:构建重组慢病毒载体pWPT-ANXA2-Flag,并检测其在小鼠肝癌细胞系Hepa 1-6的表达情况。方法:利用DNA重组技术将人膜连蛋白A2(annexin A2,ANXA2)基因克隆入慢病毒表达载体pWPT中,通过酶切、测序验证后,将重组慢病毒载体pWPT-ANXA2-Flag与包装质粒pCMV-dR8.91、pCMV-VSV-G共转染人胚肾上皮细胞株293T,包装重组慢病毒LV-ANXA2-Flag,并感染小鼠肝癌细胞株Hepa 1-6,用RT-PCR检测ANXA2 mRNA转录水平,Western blot法检测ANXA2-Flag蛋白的表达情况,应用流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果:经酶切及测序结果证实,构建了重组慢病毒载体pWPT-ANXA2-Flag;RT-PCR及Western blot结果显示慢病毒感染Hepa 1-6细胞后,ANXA2基因能够在细胞内正确的转录、翻译并稳定表达ANXA2蛋白;经过LV-ANXA2-Flag感染后,Hepa 1-6细胞S期细胞比例明显高于对照细胞。结论:成功建立ANXA2基因慢病毒表达载体pWPT-ANXA2-Flag,包装的慢病毒能够成功感染小鼠肝癌细胞系Hepa 1-6,并使ANXA2基因得以稳定表达,并通过ANXA2促进肿瘤细胞增殖。
- 杨东昌母小新刘巧玉邓蕾陈云孙倍成
- 关键词：慢病毒载体肝癌
- EB病毒潜伏膜蛋白2A基因重组逆转录病毒载体和稳定表达细胞株的构建及鉴定被引量：2
- 2009年
- 目的:克隆EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)全长基因,并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体pGEZ-LMP2A,转染真核细胞后获得稳定表达LMP2A的细胞株。方法:采用RT-PCR技术从B95.8细胞中获得EB病毒LMP2A全长基因,克隆到测序载体pMD18-T中,经测序后再亚克隆到逆转录病毒载体pGEZ-Term中,与两辅助病毒载体PHIT456、PHIT60通过Lipofectamine2000共转染包装细胞293T,测定产生的重组逆转录病毒滴度并感染小鼠成纤维细胞L929,经Zeocine筛选后得到稳定的细胞克隆,用RT-PCR和Western blot法检测细胞中LMP2A mRNA和蛋白表达情况。结果:重组逆转录病毒载体pGEZ-LMP2A经测序鉴定正确;转染后上清中病毒的滴度为5×108cfu/L,感染L929细胞后用Zeocine筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Westernblot检测结果表明筛选出的细胞克隆能稳定表达EBV-LMP2A。结论:表达EBV-LMP2A细胞株的构建为蛋白制备与纯化奠定了物质基础,也为后续的EBV相关性疾病疫苗的研究提供了新思路。
- 陈云周锋孙倍成刘根焰王冰姚堃
- 关键词：EB病毒LMP2A逆转录病毒
