重庆市科技攻关计划(2006BA5024)
- 作品数：1 被引量：7H指数：1
- 相关作者：张晓丽邹全明程琰刘艳青王庆旭更多>>
- 相关机构：第三军医大学更多>>
- 发文基金：重庆市科技攻关计划国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 原核融合表达载体的设计、构建及应用被引量：7
- 2008年
- 目的利用EspA(肠出血性大肠杆菌O157:H7Ⅲ型分泌蛋白A)作为融合伴体分子,构建一种高效原核融合表达载体。方法在EspA的羧基端设计一Linker,包括柔韧区,肠激酶酶切位点和多克隆位点。PCR分别扩增EspA、Linker基因,利用重叠延伸PCR技术获得二者融合基因,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建高效原核表达载体-pEspA。分别将IL-24、GFP等六种基因克隆入pEspA,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE检测融合蛋白。以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化融合蛋白,融合蛋白经肠激酶酶切后再通过Ni2+亲和层析柱获得外源蛋白。分别利用MTT法和紫外光激发实验鉴定IL-24、GFP生物学活性。结果构建的表达载体pEspA可高效表达外源目的蛋白,使本身不表达或表达量低的目的蛋白获得高效表达。先以EspA单克隆抗体亲和层析一步纯化获得高纯度的融合蛋白,融合蛋白经肠激酶酶切后再以Ni2+亲和层析柱获得了外源蛋白,同时生物学活性实验显示纯化的IL-24、GFP具有较好的生物学活性。结论成功构建了基于EspA的新型高效原核融合表达载体,为蛋白的融合表达及纯化又提供了一种可供选择的工具。
- 程琰毛旭虎王庆旭余抒刘艳青张晓丽宁亚蕾邹全明
- 关键词：融合表达载体肠出血性大肠杆菌O157:H7
