国家自然科学基金(30371627)
- 作品数：8 被引量：8H指数：2
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- 腺病毒载体介导人血管内皮细胞生长因子受体－2诱导抗小鼠肝癌免疫被引量：2
- 2008年
- 目的 探讨复制缺损型腺病毒载体（Ad）介导人血管内皮细胞生长因子受体-2（hKDR）诱导抗小鼠肝癌血管免疫、打破免疫耐受的效果。方法 用RT-PCR方法从人脐静脉内皮细胞和小鼠胚胎细胞中分别克隆hKDR和小鼠KDR（mKDR），构建Ad hKDR和Ad mKDR。用Ad hKDR和Ad mKDR分别皮内免疫C57BL／6小鼠，7d后取脾细胞作为效应细胞，Hepa 1-6／mKDR作为靶细胞，行乳酸脱氢酶释放试验，检测特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤率；免疫小鼠接种Hepa 1-6肝癌细胞，观察荷瘤小鼠成活情况。结果 Ad hKDR和Ad mKDR分别免疫小鼠1周后，在效应细胞：靶细胞为100：1、50：1和25：1时，Ad hKDR诱导的6h CTL杀伤率分别为84．3％±6．7％、71．5％±5．2％和44．6％±4．7％；Ad mKDR诱导的6h CTL杀伤率分别为65．2％±6．1％、46．7％±5．0％和22．6％±3．7％。Ad hKDR免疫小鼠后1周接种5×10^6个Hepal-6肝癌细胞，2个月后仍然有60％的小鼠无瘤生长；而接种2×106个Hepal-6细胞至Ad mKDR免疫小鼠，2个月后小鼠成活率为40％。上述CTL效应和肿瘤保护作用在清除CD8^＋和CD4^＋T淋巴细胞后消失。结论 Ad介导异种KDR能有效地打破肿瘤的免疫耐受，诱发强烈的抗原特异性细胞免疫反应，这种特异性细胞免疫反应是CD8^＋和CD4^＋T淋巴细胞依赖性的。
- 谭晓华吴彬刘兵刘秀丽王友臣
- 关键词：T淋巴细胞细胞毒性腺病毒载体
- 以Ad SIINFEKL—Luc为抗原研究免疫反应的量效关系
- 2007年
- 目的定量地探讨腺病毒载体编码的已知抗原与其诱发的抗原特异性细胞免疫反应的量效关系。方法用不同MOI的编码鸡卵清蛋白MHCI多肽SIINFEKL（OVAp257-264）与荧光素（luciferase，Luc）融合蛋白的腺病毒（Ad SIINFEKL-Luc）感染小鼠骨髓来源的树突状细胞（DC），在不同的时间点定量检测DC中Luc的表达；相应地，用表达不同水平SIINFEKL-Luc融合蛋白的DC皮下免疫C57BL／6小鼠，通过体内CTL杀伤试验和细胞内γ干扰素（IFN-γ）染色（ICS）定量分析CTL杀伤活性及其产生IFN-γ的能力。结果Luc在DC中的表达水平与Ad SIINFEKL-Luc所用剂量具有剂量效应关系，AdSIINFEKL-Luc一次感染后在DC中持续4d仍然检测得到Luc的表达。分别用0．1、1、10和100MOI的Ad SIINFEKL-Luc／5×10^5 DC免疫小鼠1周，体内CTL杀伤试验分析小鼠脾细胞4hCTL杀伤率分别是14．4％±2．3％、32．6％±4．5％、86．7％±3．8％和99．8％±0．3％。ICS分析脾脏IFN-γ产生的CD8^＋T细胞占总CD8^＋T细胞比率分别是0．49％±0．12％、1．74％±0．21％、4．12％±0．34％和9．53％±0．58％。结论Ad SIINFEKL-Luc表达抗原水平的高低与其诱发特异性细胞免疫反应的强弱明显相关。在一定范围内，抗原表达高低与其诱发的抗原特异性细胞免疫反应的强弱呈正相关。
- 谭晓华万永红
- 关键词：腺病毒载体树突状细胞融合蛋白免疫反应
- 不同免疫途径对抗原肽修饰DC疫苗免疫效应的影响被引量：2
- 2006年
- 目的探讨不同的免疫途径对抗原肽修饰树突状细胞(DC)疫苗免疫效果的影响。方法用鸡卵清蛋白(OVA)MHCⅠ限制性多肽SIINFEKL(OVAp257-264)包被小鼠骨髓来源的DC,通过皮下、腹腔、静脉或肌肉注射免疫小鼠,7天后行体内细胞毒性T淋巴细胞杀伤实验(InvivoCTL)分析CTL杀伤活性和细胞内IFN-γ染色(ICS)分析免疫小鼠脾脏CD8+细胞产生IFN-γ的情况。结果免疫7天后,InvivoCTL结果显示SIINFEKL修饰的DC皮下、腹腔、静脉或肌肉注射免疫小鼠其特异性CTL杀伤效应分别是37.3%±7.3%、61.0%±4.2%、56.9%±3.6%和10.8%±2.3%;ICS结果示四组小鼠产生IFN-γ的CD8+细胞占总CD8+细胞的比例分别是0.31%±0.07%、0.85%±0.12%、0.76%±0.14%和0.15%±0.04%。结论不同免疫途径可明显影响抗原肽修饰DC疫苗的免疫效应,其中腹腔注射诱发的抗原特异性CTL反应最强,静脉注射者次之,而皮下注射特别是肌肉注射较弱,提示通过腹腔注射DC疫苗可能是安全、高效的免疫途径。
- 谭晓华刘端祺
- 关键词：树突状细胞抗原肽免疫途径
- 腺病毒载体介导人KDR胞外段诱导抗小鼠肝癌的免疫效应被引量：3
- 2007年
- 目的:探讨复制缺陷型腺病毒载体(Ad)介导人血管内皮细胞生长因子受体-2(hVEGFR-2或hKDR)胞外段诱导抗小鼠肝癌血管免疫及打破免疫耐受的效果。方法:构建Ad hKDRE,用Ad hKDRE皮内免疫C57BL/6小鼠,7d后取脾细胞作为效应细胞(E),Hepa1-6/mKDR作为靶细胞(T),行乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测特异性CTL杀伤活性;给免疫小鼠接种肝癌细胞Hepa1-6,观察荷瘤小鼠成活情况。结果:Ad hKDRE免疫小鼠1周后,在E∶T为100∶1、50∶1和25∶1时,Ad hKDRE诱导的6hCTL杀伤率分别为(81.5±5.6)%、(68.4±5.5)%和(39.6±3.9)%。Ad hKDRE免疫小鼠1周后接种2×106 Hepa1-6肝癌细胞,观察2个月无小鼠成瘤;接种5×106 Hepa1-6细胞,小鼠无瘤成活率为60%。上述CTL效应和抗成瘤作用在清除CD8+和CD4+ T淋巴细胞后消失。结论:Ad介导异种(人)KDR胞外段能有效地打破小鼠肝癌的免疫耐受,诱发强烈的抗原特异性细胞免疫反应,这种特异性细胞免疫反应是CD4+和CD8+ T细胞依赖性的。
- 谭晓华吴彬王芳刘兵王友臣
- 关键词：异种抗原
- 腺病毒编码人TRP2修饰DC诱发抗小鼠黑色素瘤免疫的研究
- 2005年
- 目的比较腺病毒载体(Ad)介导人和小鼠酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase-relatedpro-tein2,TRP2)修饰小鼠骨髓来源的树突状细胞(BM-DC)诱发抗小鼠黑色素瘤免疫的差异。方法Ad编码人或小鼠TRP2(AdhTRP2或AdmTRP2)体外感染小鼠BM-DC并体内皮下免疫C57BL/6小鼠,7d后取出被免疫小鼠脾细胞行体内细胞毒性T淋巴细胞杀伤试验(invivoCTL)和细胞内IFN-γ染色(ICS)分析CTL的杀伤活性和IFN-γ的产生;或给免疫后小鼠皮下接种小鼠B16.F10黑色素瘤细胞,观察荷瘤小鼠的成活情况。结果invivoCTL和ICS分析显示,AdhTRP2/BM-DC免疫小鼠,其6hCTL杀伤率为(98.7±1.2)%,IFN-γ产生的CD8+T细胞占总CD8+T细胞的(1.25±0.21)%;而AdmTRP2/BM-DC免疫的小鼠,其6hCTL杀伤率和产生IFN-γ的CD8+T细胞比例分别为(28.6±6.3)%和(0.24±0.06)%。荷瘤试验表明,AdhTRP2/BM-DC免疫小鼠后1周皮下接种106B16.F10细胞,观察3个月100%的小鼠无瘤生长;而接种5×104B16.F10细胞至AdmTRP2/BM-DC免疫1周的小鼠,3个月后小鼠成活率仅为40%。结论Ad介导异种(人)TRP2较自身(小鼠)TRP2修饰的BM-DC更为有效地打破肿瘤免疫耐受、诱导强烈的抗黑色素瘤免疫反应,是一种高效的以DC为基础的肿瘤疫苗。
- 谭晓华Wan Yonghong
- 关键词：人腺病毒树突状细胞免疫耐受
- hKDR基因胞外区mRNA转染树突状细胞诱发对表达mKDR的Hepa1-6细胞的特异性杀伤效应
- 2009年
- 目的探讨人血管内皮细胞生长因子受体-2(KDR)胞外段(Ig1~3)mRNA修饰的树突状细胞(DC)诱发的体外特异性细胞免疫效应。方法构建pmRNA IRES-hKDR)(Ig1~3),体外转录出相应的mRNA,Western blot鉴定其蛋白表达;以hKDR(Ig1~3)mRNA致敏来源于小鼠骨髓的DC,并免疫小鼠,同时设空白DC对照组,7d后取鼠脾细胞为效应细胞,表达mKDR的肿瘤细胞为靶细胞按100∶1、50∶1、25∶1的比例混合,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测细胞毒作用。结果未经修饰DC激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对靶细胞的杀伤率为(19.6±3.7)%、(10.2±2.6)%、(6.2±2.2)%,经mRNA修饰的DC激活的CTL对靶细胞杀伤率为(75.2±2.3)%、(54.3±3.4)%、(20.9±3.1)%,同一效靶比情况下显著强于其他3组。结论hKDR(Ig1~3)mRNA致敏的DC能诱导针对Hepa1-6(mKDR)的特异性细胞免疫反应。
- 孙林英刘畅刘秀丽邵晓婷谭晓华
- 关键词：树突状细胞
- IRES增强mRNA在树突状细胞中的翻译效率有效地诱发抗肿瘤免疫被引量：2
- 2007年
- 目的旨在寻求一种能完全替代目前常规体外转录合成肿瘤相关抗原(TAA)mRNA的方法。方法构建4个质粒包括 pmRNA 荧光素(Luc)、pmRNA IRES-Luc、pmRNA 鸡卵清蛋白(OVA)和 pmRNA IRES-OVA,用 Luc 报告系统检测不同形式的 Luc mRNA 转染小鼠树突状细胞(DC)后的蛋白表达水平;以 OVA 作为靶抗原,以小鼠黑色素瘤肺转移作为动物模型,通过体内细胞毒性 T淋巴细胞(CTL)杀伤实验及荷瘤实验,比较 Capped-OVA mRNA 和 IRES-OVA mRNA 修饰 DC 所诱发的抗原特异性细胞免疫反应。结果将 IRES 序列插入 mRNA 转录模板编码基因 cDNA 序列前,不影响体外转录合成相应 mRNA 的产量。不同形式 Luc mRNA 转染 DC 后8h,IRES-Luc mRNA 较Capped-Luc mRNA 表达的酶活性高1倍,而较 Uncapped-Luc mRNA 高20倍;IRES-Luc mRNA 和Capped-Luc mRNA 转染 DC 96 h 后仍能检测到 Luc 活性。用 Capped-OVA mRNA 和 IRES-OVA mRNA修饰 DC 免疫小鼠1周后行体内 CTL 杀伤实验,结果示 Capped-OVA mRNA/DC 免疫组4 h CTL 杀伤率为(28±3)%,而 IRES-OVA mRNA/DC 免疫组4 h CTL 杀伤率为(32±4)%。荷瘤实验显示,Capped-OVA mRNA/DC 和 IRES-OVA mRNA/DC 免疫小鼠后均能保护小鼠肺部免受黑色素瘤转移结节形成。结论含 IRES 序列的 TAA mRNA 可作为一种更经济、适用的方法,完伞可以取代 Cap 化mRNA 修饰 DC,并能诱导与 Cap 化 mRNA 修饰 DC 同样有效的抗原特异性细胞免疫反应。
- 谭晓华万永红
- 关键词：癌症疫苗树突细胞免疫疗法
- pmRNA IRES-hKDR(Ig1-3)重组质粒的构建、表达及鉴定
- 2008年
- 目的:利用基因工程技术构建pmRNA IRES-hKDR(Ig1-3)重组质粒,为其应用于肿瘤的基因治疗奠定基础。方法:以本实验室构建保存的pcDNA3.1 hKDR为模板,PCR扩增hKDR(Ig1-3)cDNA片段后用Nco I和Xho I酶切后插入pmRNA IRES多克隆位点的相应位点中,经PCR、酶切和测序鉴定其序列正确性,然后用试剂盒体外转录出相应的mRNA,用脂质体转染COS-7细胞,经G418筛选后通过免疫组化和Western blot检测该融合蛋白。结果:PCR、酶切和测序证实pmRNA IRES-hKDR(Ig1-3)构建成功,体外转录出相应的mRNA,免疫组化和Western blot检测出其蛋白表达。结论:成功构建含pmRNA IRES-hKDR(Ig1-3)的真核表达重组质粒,有助于进一步研究其抗肿瘤作用。
- 孙林英刘畅胡锋涛刘秀丽邵晓婷刘端祺谭晓华
- 关键词：质粒基因表达调控
