国家自然科学基金(30470746)
- 作品数：5 被引量：22H指数：3
- 相关作者：金洁童向民郑水儿薛永权钱文斌更多>>
- 相关机构：浙江大学医学院附属第一医院苏州大学浙江大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金浙江省科技厅基金浙江省科技厅科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 人端粒酶逆转录酶和人白细胞介素18融合基因真核表达载体的构建和功能研究被引量：3
- 2006年
- 目的:以基因重组技术在真核细胞中表达人白细胞介素18(hIL-18)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)融合基因,并观察其生物学功能。方法:健康人单核细胞经RT-PCR扩增hIL-18后、T-A克隆。亚克隆至经N heⅠ、H indⅢ酶切的PCDNA 3.1(+)/hTERT中,限制性内切酶验证后,挑选出含有目标基因的正确克隆。经限制性内切酶和DNA测序分析两个基因是否已经正确连接到真核表达载体中。将hTERT/hIL-18融合基因质粒脂质体介导转染3T 3细胞中表达,经W estern-b lot验证目的基因表达产物,同时对转染细胞作免疫荧光染色。以EL ISA检测转染细胞刺激KG-1细胞分泌γ干扰素的能力,以流式细胞仪检测转染细胞抗MTX诱导凋亡的能力。结果:hTERT/hIL-18融合基因的真核表达载体PCDNA 3.1(+)构建成功,经限制性内切酶验证和DNA测序及同源性对比分析,该基因片段与NCB I基因库hIL-18和hTERT基因CDS序列同源性均达到99.9%;而细胞转染后经W estern-b lot验证,hTERT/hIL-18融合蛋白的分子量约127 kM r,与预期一致,荧光显微镜观察显示融合蛋白在细胞中弥散表达。此融合蛋白能刺激KG-1细胞分泌γ-干扰素,并具有抗MTX诱导凋亡的生物学功能。结论:本实验构建的PCDNA 3.1(+)/hTERT-hIL-18质粒能够在真核细胞中表达,并具有生物学功能,为进一步转染树突状细胞,研制肿瘤的治疗性疫苗提供基础。
- 童向民金洁姚航平钱文斌孟海涛
- 关键词：白细胞介素18基因表达端粒酶逆转录酶蛋白
- STI571对慢性髓细胞白血病树突状细胞发育的影响被引量：1
- 2006年
- 目的研究STI571对慢性髓细胞白血病(CML)树突状细胞(DC)发育的影响。方法分离CML患者及正常人的骨髓单个核细胞,将实验分为CML实验组、CML对照组及正常对照组。CML对照组及正常对照组:在培养体系中加入重组人粒单核细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素4(rhIL-4)培养;CML实验组:在对照组的基础上,再加入药物STI571培养。于实验第8天,各组加入重组人肿瘤坏死因子α(rhTNF-α)进一步刺激成熟。Wright染色观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表型,荧光原位杂交(FISH)进行细胞遗传学分析,混合淋巴细胞反应(MLR)检测抗原递呈功能;ELISA法检测培养上清中血管内皮生长因子(VEGF)的浓度。结果各组均呈现典型的树突状细胞形态;CML实验组CD80、CD86、CD83和HLA-DR的表达均显著高于CML对照组(P<0．05),经FISH证实,CML DC来源于白血病细胞;各组DC均具有刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力,CML实验组刺激淋巴细胞增殖的能力显著高于CML对照组(P<0．05),而与正常对照组相似(P>0．05); CML实验组VEGF的浓度较CML对照组显著降低(P<0．D5)。结论STI571可促进CML骨髓来源DC的活化,可能与其抑制了CML细胞VEGF的过度分泌,从而解除了VEGF对CML DC的分化抑制有关。
- 郑水儿金洁童向民钱文斌薛永权
- 关键词：白血病慢性髓细胞树突细胞STI571
- 甲磺酸伊马替尼对慢性髓细胞白血病树突状细胞发育的影响及机制探讨
- 2006年
- 目的研究甲磺酸伊马替尼(Imatinib,STI571)对慢性髓细胞白血病(CML)树突状细胞(DC)发育的影响及探讨其可能作用机制。方法分离CML骨髓单个核细胞,在培养体系中加入重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4(rhIL-4)培养(对照组)和在此基础上再加入STI571培养(实验组),于第8天加入重组人肿瘤坏死因子α(rhTNF-α)进一步刺激成熟。观察培养后细胞形态、表型、混合淋巴细胞反应等指标,检测培养上清血管内皮生长因子(VEGF)浓度、细胞核因子κB(NF-κB)活性。结果2组均呈现典型的树突状细胞形态,实验组CD80、CD86、CD83和人类白细胞抗原DR(HLA-DR)的表达、刺激淋巴细胞增殖的能力显著高于对照组(均P<0．05);实验组VEGF浓度显著低于对照组(P<0．05),而NF-κB活性显著高于对照组(P< 0．05)。结论STI571可促进CML骨髓来源DC的活化,这可能与其解除了CML来源VEGF对DC NF-κB活性的抑制有关。
- 郑水儿金洁童向民
- 关键词：STI571
- 干扰素-α联合GM-CSF诱导慢性髓性白血病细胞向树突状细胞分化被引量：6
- 2006年
- 目的:研究干扰素-α(IFN-α)对慢性髓性白血病(CML)骨髓单个核细胞来源的树突状细胞(DCs)发育的影响。方法:12例初发慢性期CML患者的骨髓单个核细胞,分别与含如下细胞因子,RPMI-1640培养液共育:rhGM-CSF1×106U/L联合rhIFN-α2×106U/L(IFN-α组)、rhGM-CSF1×106U/L联合rhIL-45×105U/L(IL-4组)、单用rhGM-CSF1×106U/L和单用rhIFN-α2×106U/L,培养7d;于第8-10d,部分孔加入rhTNF-α5×104U/L。形态学(Wright染色、倒置显微镜)、免疫学(CD80、CD86、CD83、CD1a、HLA-DR)检测;磷脂酰丝氨酸(PS)转位检测DCs凋亡情况;荧光原位杂交(FISH)对1例CML进行细胞遗传学分析;混合淋巴细胞反应(MLR)检测刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果:CML骨髓单个核细胞经上述细胞因子诱导7d后,IFN-α组和IL-4组均呈现树突状细胞的典型形态;免疫学鉴定,IFN-α组DCsCD80、CD86、CD83、HLA-DR的表达显著高于IL-4组(P<0.05),经5×104U/LrhTNF-α作用后,两组DCsCD80、CD86、CD83、HLA-DR进一步上调,其中IFN-α组DCsCD80、CD86、CD83、HLA-DR的表达显著高于IL-4组(P<0.05);经FISH证实来源于白血病细胞;两组DCs均具有刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力,IFN-α组刺激淋巴细胞增殖的能力明显高于IL-4组(P<0.05)。结论:IFN-α可促进CML骨髓单个核细胞来源的树突状细胞的分化、活化。这可能是IFN-α在CML中的治疗机制之一。
- 金洁郑水儿童向民薛永权
- 关键词：干扰素Α
