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人β-防御素2在大肠杆菌中的高效表达和纯化被引量：7: 2006年; 目的:研究具有生物学活性的人防御素2(HBD 2)多肽在大肠杆菌中的原核高效表达的可行性及融合表达蛋白的分离纯化技术。方法:PCR扩增不含前导序列的HBD 2成熟肽的编码框全长的cDNA片段(smHBD 2-cDNA),利用B g lⅡ和B amHⅠ同尾酶构建多拷贝串联的nsmHBD 2-cDNA的克隆载体,利用N colⅠ和H indⅢ限制性内切酶构建融合表达载体pET 32-nsmHBD 2-cDNA,在大肠杆菌中BL 21(DE 3)中诱导表达含HBD 2的融合蛋白,SDS-PAGE分析产量。可溶蛋白经亲和层析、肠激酶酶切、离子交换层析等方法分离、纯化HBD 2多肽。采用液体培养法,测定重组人β防御素2对大肠杆菌的抑菌活性。结果:构建了n为1、2、4或8倍的多拷贝串联nsmHBD 2-cDNA表达载体,1、2和4倍smHBD 2-cDNA的可溶蛋白比例分别为52%、48%和31%;而8倍HBD 2-cDNA几乎不含可溶蛋白,目标蛋白以包含体形式表达,集中在不可溶部分。重组HBD 2对E.coli K 12 D 31有较强的抑制作用,在终浓度约为0.4至0.5μg/m l时,90%细胞的生长被抑制。结论:采用融合表达、多拷贝串联表达方式,可增加产物长度以弱化蛋白酶的降解作用,也减弱了目标蛋白产物对宿主的毒性;适当的多拷贝串联基因可以提高HBD 2的产量,但拷贝数过高会影响重组蛋白表达产量,且易形成不溶蛋白;在大肠杆菌中可达到具有生物学活性的HBD 2多肽的原核高效表达。; 钟志霞阮红范立梅彭力方向明徐志南; 关键词：Β-防御素抗菌肽

β-防御素2基因腺病毒表达载体的构建与真核表达被引量：3: 2006年; 目的:探讨重组腺病毒载体在真核细胞中稳定表达阳离子抗菌肽——β-防御素2的可行性。方法:采用RT-PCR方法扩增得到大鼠β-防御素2(rBD 2)基因片段,定向插入到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,重组质粒pShuttle-CMV-rBD 2转化E.coli B J5183-AD-1后,与腺病毒基因组质粒pA dE asy-1发生同源重组,重组质粒pA dE asy-rBD 2转染293细胞进行腺病毒表达载体的包装。将包装成功的腺病毒感染cos-7细胞,并建立SD大鼠腺病毒感染模型,进行β-防御素2多肽的体外和体内表达,采用W estern b lot与免疫组化方法检测其表达。结果:重组腺病毒表达载体构建成功,包含大鼠β-防御素2基因,滴度达到109PFU/m l,W estern b lot与免疫组化方法分别检测到β-防御素2在SD大鼠体外、体内的表达。结论:重组腺病毒载体能在真核细胞中稳定表达阳离子抗菌肽——β-防御素2。; 石卓舒强赵正言陈智姚航平方向明; 关键词：Β-防御素腺病毒表达载体

重组β-防御素2在脓毒症所致大鼠急性肺损伤发生发展中的作用被引量：3: 2006年; 目的:探讨重组β-防御素2(BD 2)对脓毒症所致大鼠急性肺损伤的保护作用以及对预后的改善。方法:SD大鼠36只随机分为对照组及实验组,每组各18只,分别予以气管滴注对照腺病毒载体(A d-V,107PFU/m l)及可表达大鼠β-防御素2(rBD 2)的腺病毒载体(A d-rBD 2,107PFU/m l)各100μl。48 h后行盲肠结扎穿孔复制脓毒症模型;复制此模型后36h处死大鼠(n=12,实验组、对照组各6只),行腹腔灌洗液细菌计数、肺组织常规病理切片观察以及大鼠生存率分析(n=24,A d-V组、A d-rBD 2组各12只)。结果:与对照组(A d-V组)比较,实验组(A d-rBD 2组)肺组织损伤程度减轻,生存率明显提高(P<0.05),腹腔灌洗液细菌计数无明显差别。结论:在体内表达的重组β-防御素2可明显改善脓毒症所致的急性肺损伤的肺部病变及其预后。; 石卓赵正言舒强陈智姚航平方向明; 关键词：Β-防御素腺病毒表达载体急性肺损伤盲肠结扎穿孔

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浙江省科技厅基金(001103241)

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