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携带抗口蹄疫病毒ScFv基因猪成纤维细胞系的建立: 2012年; 根据口蹄疫病毒的感染特征及其在临床发病过程中呈现的症状,筛选抗口蹄疫病毒单链抗体基因。通过EcoRⅠ/NotⅠ双酶切中间质粒pGEX-ScFv获得单链抗体基因片段,并克隆至反转录病毒载体质粒pFB-neo,构建反转录病毒穿梭载体质粒pFB-ScFv。将pFB-ScFv与辅助质粒pVPack-GP、pVPack-10A1共转染HEK293T细胞,包装重组反转录病毒MMLV-ScFv。同时,构建含增强型绿色荧光蛋白基因的重组反转录病毒MMLV-EGFP作为对照。利用所包装重组反转录病毒感染猪成纤维细胞,通过G418筛选获得携带目的基因的单克隆细胞集落。试验结果表明,本试验在成功构建反转录病毒穿梭载体pFB-ScFv和pFB-EGFP的基础上,获得了分别携带抗口蹄疫病毒单链抗体基因和增强型绿色荧光蛋白基因的反转录病毒,并最终筛选出分别携带上述基因的猪成纤维细胞克隆,为抗口蹄疫病毒转基因动物的研究奠定了基础。; 孙丹丹李霄王婧尹熙俊康锦丹鲁月李太元金宁一; 关键词：口蹄疫病毒反转录病毒单链抗体转基因

利用体细胞核移植技术生产表达红色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎研究: 2011年; [目的]为生产转基因克隆猪奠定基础。[方法]以反转录病毒转染的带有红色荧光蛋白(RFP)基因的猪胎儿成纤维细胞作为核移植的核供体,利用体细胞克隆技术研究红色荧光蛋白克隆胚胎体外发育情况。[结果]RFP转基因细胞的融合率为83.87%,与未转基因细胞(80.56%)相比无显著差异(P>0.05);RFP转基因体细胞重构胚体外囊胚率为8.67%,与未转基因细胞组(6.56%)相比无显差异著(P>0.05);RFP转基因体细胞重构胚移植于15头受体后,尚无受孕个体。[结论]利用转红色荧光蛋白基因的细胞为供体细胞,能够成功克隆出转基因胚胎,并获得转基因囊胚。; 康锦丹尹熙俊赵明辉梁爽刘希李文学崔成哲; 关键词：转基因红色荧光蛋白核移植

缺失E3L基因减毒天坛株痘苗病毒的构建及筛选被引量：4: 2011年; 通过在E3L同源重组臂中插入含有增强型痘苗病毒早晚期启动子(pE/L)、增强型绿色荧光蛋白基因和同向Loxp(Locus of X-over P1)序列的表达盒构建穿梭质粒pTE-EGFP。利用pTE-EGFP和野生型天坛株痘苗病毒共转染仓鼠肾细胞(BHK-21),通过对绿色荧光蚀斑的10次筛选,构建缺失E3L基因并含有EGFP基因的重组痘苗病毒rTTVV-TE--EGFP+。利用rTTVV-TE--EGFP+和含有Cre(Cyclization recombination)重组酶基因的重组质粒pVAX1-Cre共转染BHK-21细胞,通过对无荧光蚀斑的10次筛选,构建无筛选标记的天坛株痘苗病毒减毒株rTTVV-TE--,并利用聚合酶链式反应(PCR)对其进行鉴定。鉴定结果显示,rTTVV-TE--中无E3L基因转录和EGFP基因表达。以上结果说明,所构建的痘苗病毒减毒株rTTVV-TE--完全缺失了E3L基因和外源筛选标记EGFP基因,且具有良好的遗传稳定性。; 王宇航李霄王浩然阚式绂王卓越齐延新吴娜杜寿文金宁一; 关键词：病毒载体

重组腺病毒Ad－HP对肝癌细胞及肝癌肺转移模型的抑制效应: 2012年; 为探讨重组腺病毒Ad-HP对人肝癌细胞BEL-7402的影响及其对鼠肝癌肺转移模型的抑制作用,本研究利用MTT染色法进行了Ad-HP的体外抑瘤研究,并应用Annexin V检测、Caspase活性检测、AO/EB染色和DAPI染色等方法分析了Ad-HP的抑瘤方式。另外,本研究利用鼠肝癌细胞H22,建立了肝癌肺转移动物模型,并检测了Ad-HP对肝癌肺转移的抑制作用及其对模型动物免疫的影响。结果表明,Ad-HP能够有效抑制BEL-7402细胞的生长,且其作用具有一定时效和剂效关系趋势;Ad-HP感染导致BEL-7402细胞呈现磷脂膜外翻、细胞核皱缩、细胞膜通透性增加和Caspase酶活性增强等典型凋亡特征;应用Ad-HP治疗肿瘤模型能够有效延长模型动物平均生存期,控制转移灶形成,增强NK和CTL活性,上调Th1类细胞因子水平。总之,Ad-HT能够通过诱导细胞凋亡抑制BEL-7402肿瘤细胞增殖,并且能够有效控制肝癌肺转移灶形成,延长模型动物平均生存期。; 齐延新王浩然李霄王卓越胡宁宁郭欢欢吴娜金宁一; 关键词：NDV HN基因重组腺病毒肝癌

表达Apoptin基因抗肿瘤双特异性重组腺病毒的构建及鉴定被引量：1: 2011年; 为研发一种安全、特异、高效的抗肿瘤基因治疗候选药物,本试验基于人端粒酶启动子(hTERTp)、人5型腺病毒复制必需基因(E1a)和特异性抑癌基因(Apoption),利用RAPAd.Ⅰ腺病毒载体系统,构建了一种具有肿瘤特异性杀伤和特异性复制能力的双特异性抗肿瘤重组腺病毒Ad-VT。并利用人肝癌细胞(HepG-2)、人肺癌细胞(A549)、人宫颈癌细胞(Hela)、人胚胎肺细胞(WI-38)和非洲绿猿肾细胞(Vero)对hTERTp的肿瘤特异性进行鉴定。结果显示,hTERTp可在HepG-2、A549和Hela等肿瘤细胞内特异性启动外源基因的表达,而在WI-38、Vero等正常细胞内不能启动相关基因表达。用RT-PCR及Western-blot等方法对Apoptin基因和E1a基因的转录和表达进行了鉴定。结果表明,Ad-VT能够有效表达Apoptin和E1a等外源基因。; 王卓越李霄王浩然阚式绂王宇航齐延新吴娜刘燕瑜金宁一; 关键词：APOPTIN HTERT启动子基因治疗

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转基因生物新品种培育专项(2009ZX08006-002B)