国家自然科学基金(30570851)
- 作品数：7 被引量：26H指数：3
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- 低氧诱导肌成纤维细胞生成并通过ERK1／2途径促进Ⅰ型胶原的表达被引量：1
- 2008年
- 目的:探讨低氧能否激活成纤维细胞转化为肌成纤维细胞,以及低氧环境对肾皮质肌成纤维细胞表达Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)的影响及其可能的信号通路。方法:(1)采用正常大鼠肾成纤维细胞系(NRK-49F),应用Western blotting方法检测低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达;比较低氧和正常氧条件下α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白水平。(2)原代培养正常大鼠肾皮质肌成纤维细胞,Western blotting方法检测低氧和正常氧条件下,HIF-1α和Ⅰ型胶原蛋白水平以及ERK1/2的活化及其特异阻断剂PD98059的阻断效应;RT-PCR方法检测Ⅰ型胶原mRNA表达水平;细胞免疫化学法检测HIF-1α胞内表达部位的变化;明胶酶谱法检测细胞上清中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的活性。结果:(1)低氧刺激6 h,NRK-49F细胞和肌成纤维细胞胞内和核内均有HIF-1α蛋白表达,核内更明显。(2)低氧培养12 h,NRK-49F细胞表达α-SMA蛋白明显增高,是正常氧组的187%±32%(P<0.05),验证了低氧可引起成纤维细胞表型转化。(3)低氧刺激原代培养的正常大鼠肾皮质肌成纤维细胞6 h、12 h上清中Ⅰ型胶原蛋白水平增加,分别为正常氧组的171%±27%(P<0.05)和256%±61%(P<0.05);低氧刺激4 h、6 h,Ⅰ型胶原mRNA表达增加,为正常氧组的189%±28%(P<0.05)和221%±44%(P<0.05)。(4)低氧刺激肌成纤维细胞6 h、12 h、24 h,培养上清液中MMP-9、MMP-2活性无明显变化。(5)低氧刺激肌成纤维细胞15 min即可使ERK1/2活化,阻断实验显示,PD98059可以使低氧12h引起Ⅰ型胶原增加(低氧刺激组为正常氧对照组的273%±51%,P<0.05)显著减少(PD98059+低氧组为正常氧组的108%±19%,P>0.05)。结论:低氧促肾纤维化可能与其诱导肾成纤维细胞转化为肌成纤维细胞并经ERK1/2途径增加Ⅰ型胶原蛋白的表达有关。
- 郭丽萍黄海长李惊子
- 关键词：低氧肌成纤维细胞ERK1/2通路
- 结缔组织生长因子通过ERK1／2途径刺激肾脏成肌纤维细胞增殖和Ⅰ型胶原生成被引量：3
- 2008年
- 目的观察结缔组织生长因子（CTGF）对大鼠肾脏成肌纤维细胞增殖及细胞外基质（ECM）成分Ⅰ型胶原生成的影响，并探讨ERKI／2途径在其中的作用。方法原代培养肾皮质成肌纤维细胞，应用5’-溴-2’-脱氧尿嘧啶（Brdu）掺入法和细胞计数法检测细胞增殖；Western印迹法检测细胞上清液中Ⅰ型胶原的蛋白水平及细胞内ERK1／2的磷酸化水平。结果CTGF明显促进成肌纤维细胞的增殖，呈时间和剂量依赖性，100μg/L组第4天时，细胞数为对照组的1．6倍（P〈0．05）。CTGF刺激可显著增加培养上清液中Ⅰ型胶原的蛋白水平[为对照组的（2．6±1．2）倍，P〈0．05]。CTGF刺激细胞5min后ERK1／2即发生磷酸化，持续至15min，30min以后迅速降至基础水平。用ERK1／2阻断剂PD98059预处理30min后，CTGF促进细胞增殖效应（7％±5％比85％±7％，P〈0．01）和促Ⅰ型胶原分泌作用（1．0±0．1比1．6±0．3，P〈0．05）被显著抑制。结论CTGF能够促进成肌纤维细胞的增殖和Ⅰ型胶原的分泌，其作用可能通过ERK1／2信号通路实现。
- 高绪霞黄海长李晓玫
- 关键词：结缔组织生长因子成肌纤维细胞ERK1/2信号通路
- 低氧促进肌成纤维细胞表达和分泌结缔组织生长因子及纤维连接蛋白被引量：11
- 2007年
- 目的:观察低氧对肾肌成纤维细胞合成和分泌结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)和细胞外基质纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的影响,以了解肌成纤维细胞在肾间质纤维化过程中的作用。方法:(1)采用原代培养正常大鼠肾皮质肌成纤维细胞,以密闭的细胞培养罐造成低氧环境(1%O2,体积分数),应用Westernblot方法检测低氧和正常氧(21%O2,体积分数)条件下低氧诱导因子-1α(hypoxiainducedfactor-1α,HIF-1α)蛋白的表达,验证所营造的低氧条件是可靠的。(2)用Westernblot方法检测在低氧和正常氧条件下,各时间点上细胞及上清液中CTGF和FN蛋白水平。(3)用RT-PCR方法检测低氧和正常氧条件下,各时间点FNmRNA表达的变化。(4)用明胶酶谱法检测细胞上清液中基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloprotei-nase-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9,MMP-9)的活性。结果:正常氧组HIF-1α蛋白表达微弱,低氧组有较高水平HIF-1α蛋白表达。低氧作用于原代培养的肌成纤维细胞6h,12h和24h后细胞内的CTGF蛋白均比正常氧组增高,分别为175%±52%,347%±67%和143%±27%,以12h最明显(P<0.05);低氧刺激24h时上清液中CTGF蛋白显著增加,是正常氧组的348%±99%(P<0.05);低氧刺激肌成纤维细胞6h,12h和24h后上清液中FN蛋白水平增加,分别是正常氧组的187%±42%,199%±51%和210%±29%,以24h最明显(P<0.05),而对应时间点上清液中MMP-9和MMP-2活性无明显变化,但细胞内FN蛋白减少,低氧剌激6h为正常氧组的64%±13%。低氧刺激肌成纤维细胞3h,FN的mRNA水平开始上升,6h达到正常氧组的135%±13%(P<0.05),12h下降接近正常氧水平。结论:低氧可通过促进肌成纤维细胞表达CTGF和FN参与肾间质纤维化的进展。
- 郭丽萍黄海长李惊子
- 关键词：低氧肌成纤维细胞纤连蛋白类结缔组织
- 大鼠肾皮质成肌纤维细胞的体外培养被引量：4
- 2007年
- 目的建立肾脏成肌纤维细胞的培养方法，为肾脏纤维化的发病机制和防治措施体外研究提供细胞技术平台。方法采用肾皮质组织块接种培养法，培养的细胞通过相差显微镜观察形态、电镜下观察细胞器，细胞免疫化学染色检测细胞表型标记蛋白等进行鉴定。同时检测细胞对不同细胞因子的生长反应。结果培养的细胞呈梭形，单个核，多突起，表达波形蛋白（vimentin）和平滑肌肌动蛋白（α，SMA），不表达主要存在于血管内皮细胞的抗原上皮氨基肽酶P（EAP），不表达角蛋白（cytokerafin）和结蛋白（desmin）。细胞可以传代至5代，并且保持成肌纤维细胞表型。转化生长因子β1、结缔组织生长因子刺激细胞增殖，而γ-干扰素对细胞无增殖效应。结论原代培养细胞为成肌纤维细胞并且可以传代，具备对细胞因子的生长调节反应，为后续实验提供了基础。
- 高绪霞黄海长李晓玫
- 关键词：肾皮质成肌纤维细胞原代培养
- 雷帕霉素抑制结缔组织生长因子诱导的成肌纤维细胞增殖及细胞外基质蛋白的分泌被引量：3
- 2009年
- 目的探讨雷帕霉素（RAPA）对于结缔组织生长因子（CTGF）生物学作用的影响及可能机制。方法分别用RAPA20μg／L和40μg／L预处理成肌纤维细胞（MyoF）30min后再加入CTGF100μg／L，与单独加入CTGF（CTGF组）和未加任何刺激的MyoF（对照组）进行比较。采用BrdU掺入法检测细胞的增殖反应；用Western印迹法检测细胞上清中纤连蛋白（FN）的水平及细胞ERK1／2信号的磷酸化。结果与对照组相比，CTGF（100μg／L）显著促进MyoF增殖（P〈0．01），增加上清中FN的蛋白水平（P〈0．05）。与CTGF组相比，RAPA20μg／L及40μg／L预处理可使细胞增殖率显著下降，分别下降了62％和70％（均P〈0．05），但两个剂量之间差异无统计学意义；使细胞上清中FN的蛋白水平分别下降了15％和44％，后者与CTGF组的差异有统计学意义（P〈0．05）。CTGF（100μg／L）刺激10min可致MyoF的ERK1／2发生磷酸化，RAPA40μg／L预处理细胞30min可显著降低CTGF诱导的ERK1／2磷酸化。以ERK1／2活化特异抑制剂PD98059（50μmol／L）预处理30min后，可以抑制CTGF诱导的细胞增殖效应（7％±5％比85％±7％，P〈0．01）和FN的分泌效应（1．0±0．1比1．6±0．3，P〈0．05）。结论RAPA具有部分抑制CTGF的促增殖和促细胞外基质分泌的作用，其作用可能通过抑制ERK1／2信号通路实现。
- 高绪霞黄海长李晓玫
- 关键词：纤连蛋白类西罗莫司成肌纤维细胞结缔组织生长因子ERK1/2信号通路
- 成肌纤维细胞在纤维化过程中的作用及其调控被引量：5
- 2007年
- 成肌纤维细胞(myofibroblast)是伤口愈合和各种组织纤维化中起主要作用的细胞,成肌纤维细胞不能及时从病变处退出,使细胞外基质持续过量分泌,并发生重塑是组织纤维化的主要特征,这一病理过程受诸多因素的调控,研究成肌纤维细胞的分化增殖及凋亡的调控机制有助于寻找干预组织纤维化过程的关键环节,从而为延缓或逆转组织纤维化提供理论基础。
- 高绪霞黄海长李晓玫
- 关键词：成肌纤维细胞纤维化分化增殖凋亡
- 西罗莫司对肌成纤维细胞表达Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白的抑制作用被引量：2
- 2008年
- 目的:在细胞水平探讨西罗莫司[sirolimus,又名雷帕霉素(rapamycin)]的抗肾纤维化作用。方法:采用原代培养的大鼠肾皮质肌成纤维细胞(myofibroblast,MyoF)。实验各时间点分别设对照组和用西罗莫司40mg/L处理组。将细胞培养12h,24h,48h后分别收集细胞和细胞培养上清液,用Western blot方法检测细胞内α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen,ColⅠ-)和上清液中FN,ColⅠ-蛋白水平的表达;用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)法检测细胞培养1h,2h,4h,6h各时间点前胶原Ⅰ(procollagenⅠ-)mRNA表达的变化;用明胶酶谱法检测细胞培养上清液中基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的活性。实验结果分别以各时间点对照组作为基线1,计算与对照组的比值。结果:(1)西罗莫司于各个时间点对细胞内α-SMA的表达均无影响。(2)用西罗莫司处理后,于24h对细胞内ColⅠ-蛋白表达量明显少于对照组,并持续至48h,分别为各时间点对照组的(0.58±0.05)倍和(0.63±0.18)倍,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)与各时间点对照组相比,细胞内procollagen-ⅠmRNA在1h,2h时表达均减少,分别为(0.38±0.05)倍和(0.55±0.16)倍,差异有统计学意义(P<0.05),于4h恢复到基础水平。(4)培养细胞上清液中12h即有ColⅠ-基础表达,经西罗莫司处理24h其表达量较对照组明显减少,为对照组的(0.59±0.25)倍,差异有统计学意义(P<0.05),持续至48h仍呈减少趋势,为对照组的(0.52±0.21)倍,P<0.05。(5)细胞内FN蛋白表达趋势与上清液中一致,24h其表达量较对照组明显减少,分别为对照组的(0.44±0.09)倍和(0.40±0.15)倍,差异均具有统计学意义(P<0.05),48h西罗莫司对FN的抑制作用消失。(6)经西罗莫司处理12h,24h和48h,上清液中MMP-2和MMP-9的活性均无明显变化。结论:西罗莫司可以通
- 张兰黄海长李惊子刘颖
- 关键词：西罗莫司成纤维细胞纤连蛋白类
