目的利用粉尘螨变应原第1组分重组蛋白rDer f 1建立特异性IgE ELISA检测方法,并对哮喘患者血清进行检测。方法以rDer f 1为包被抗原,分别建立间接ELISA法和亲和素-生物素复合ELISA(ABC-ELISA)法,检测Der f 1特异性IgE阳性标准血清和39例哮喘患者血清中的Der f 1特异性IgE,并分析检测结果。结果间接ELISA法和ABC-ELISA法检测Der f 1特异性IgE的最适抗原包被浓度和血清稀释倍数均为15μg/ml和1︰2,间接ELISA法辣根过氧化物酶(HRP)标记抗人IgE抗体适宜稀释倍数为1︰1 000,ABC-ELISA法生物素标记抗人IgE抗体和HRP标记亲和素的稀释倍数分别为1︰1 000和1︰2 000。用间接ELISA和ABC-ELISA检测IgE的灵敏度分别为0.68U/ml和0.73U/ml,检测患者血清中Der f 1特异性IgE的阳性率分别为92.3%和97.4%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论基于重组变应原rDer f 1的ELISA法检测粉尘螨特异性IgE具有较高的敏感度,可用于螨过敏性疾病的实验诊断。
目的应用基因工程技术获得纳米级粉尘螨变应原第1组分s-layer/Der f 1,建立重组纳米级变应原的方法。方法利用S-layer/Strep-tag I这一具有自我组装能力的纳米模式母体嵌合粉尘螨变应原第1组分,并置大肠杆菌中表达,用分离纯化获得的表达产物免疫治疗哮喘小鼠,从分子、细胞、组织和器官4个层面证实该重组变应原诱导哮喘小鼠免疫耐受的可能性和有效性。结果采用基因工程技术将球形芽孢杆菌S层蛋白编码基因sllB的3′端去除600 bp后与尘螨主要变应原第1组分Der f 1连接,5′端与Strep-tag I的编码基因连接,成功构建克隆质粒pMD19-T-Strep-tag I/sllB1-2 706 bp/Der f 1,测序正确后,成功构建表达质粒pET28a(+)-Strep-tag I/sllB1-2 706 bp/Der f 1并转化E.coli BL21诱导表达,透射电镜显示该表达产物rDer f 1/S-layer位于工程菌表面,平均粒径为(116.43±14)nm。用获得的重组变应原rDer f 1、rDer f 1/S-layer免疫治疗哮喘小鼠,证实其可改善小鼠肺部炎症,降低支气管肺泡灌洗液中细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和总IgE、螨特异性IgE水平,增加总IgG、螨特异性IgG水平,并上调外周血Th1型、下调Th2型细胞因子表达水平,并以重组纳米级变应原疗效更好,免疫调节作用更强。结论获得了纳米级粉尘螨变应原第1组份重组体,该制品可以诱导哮喘小鼠免疫耐受,具有较强的免疫原性,所建立的纳米级变应原原核表达体系为生产纳米药物和疫苗提供了一个新的途径。
目的获得粉尘螨变应原第3组分(Der f 3)的编码基因并了解其序列多态性。方法根据GenBank已公布的Der f 3核酸序列设计引物,用RT-PCR扩增获得其编码基因,插入pMD19-T载体,进行序列测定和多态性分析。结果获得粉尘螨变应原Der f 3编码基因为780bp。5株Der f 3基因cDNA克隆的核苷酸序列与参考序列(GenBankNo.AY 283291,GenBank No.D63858,GenBank No.EU312162,GenBank No.EU312163)相比,有19处cDNA序列发生突变,但有7处突变至少在3个cDNA克隆中序列一致;推导出氨基酸序列后进行比对,有11处氨基酸序列发生变化,有4处与上述7个位点相一致。结论获得了粉尘螨变应原Der f 3编码基因且证明其序列具有多态性,为进一步开展相关研究奠定了基础。
目的建立粉尘螨变应原第1组分全长基因原核表达质粒pColdTFDer f 1。方法以质粒pET-28a(+)Der f 1为模板扩增目的基因Der f 1,克隆至pColdTF DNA载体,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达并用SDSPAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)和蛋白印迹法(Western blotting,WB)验证产物。结果 PCR扩增获得Der f 1编码全长基因,成功构建表达质粒pColdTFDer f 1,SDSPAGE和WB验证表明该质粒在大肠埃希菌中正常表达,且基本为可溶性表达。结论成功建立尘螨变应原原核表达质粒pColdTFDer f 1,并成功实现其原核表达,为进一步生产基因工程变应原提供基础依据。
